Caracterización genómica e identificación del sitio de recombinación de dos cepas recombinantes de herpesvirus bovino 1 y 5.

DEL MÉDICO ZAJAC, M.P.; THIRY, E.; ROMERA, S.A. Y MUYLKENS, B.

Congreso; IX congreso Argentino de Virología; 2008

Los herpesvirus bovino 1 y 5 (BoHV-1 y BoHV-5) son dos alfaherpesvirus que infectan al ganado bovino y establecen latencia en ganglios sensoriales. El BoHV-1 induce un cuadro de infecciones respiratorias, genitales y/o reproductivas de variada severidad. El BoHV-5 induce como cuadro más severo una meningoencefalitis que desencadena la muerte del animal infectado, aunque, con mayor frecuencia, se presentan casos de infección subclínica o signos nerviosos leves. Las infecciones con BoHV-1 presentan una distribución mundial, mientras que los casos de infección con BoHV-5 están acotados geográficamente. En Argentina los índices de seroprevalencia de BoHV-1 promedian el 60 % del ganado bovino, mientras que, si bien se reportan casos de infecciones con BoHV-5, no existen datos certeros sobre su prevalencia debido a la falta de ensayos serológicos diferenciales. En los herpesvirus la recombinación es un fenómeno muy frecuente que contribuye a la evolución de los mismos y genera gran diversidad entre cepas. La recombinación genética no está restringida a situaciones experimentales ya que existen reportes sobre la existencia de cepas recombinantes naturales. Recientemente, se obtuvieron dos virus recombinantes BoHV-1/5 luego de un ensayo de coinfección in vitro utilizando un virus salvaje de BoHV-5 (cepa N569) y un virus doble deleteado de BoHV-1.2 (cepa Aus12 gC- GFP+ gI- RFP+). Basándose en análisis con anticuerpos monoclonales y RFLP se demostró que dichos recombinantes contienen regiones genómicas homólogas a cada virus parental. El objetivo de este trabajo es la caracterización de la constitución genómica de estos virus recombinantes BoHV-1/5 identificando la región donde se produjo el evento de recombinación. Debido al gran tamaño del genoma de los alfaherpesvirus (aproximadamente 140 kpb) se eligió como estrategia de trabajo la amplificación por PCR y secuenciación de fragmentos de aproximadamente 150-340 pb en genes separados por 8-15 kpb. Los oligonucleótidos se diseñaron sobre las regiones genómicas más divergentes entre BoHV-1 y BoHV-5. De esta manera, se obtuvo un mapeo del genoma de los virus recombinantes y se identificó el sitio de recombinación en cada uno. En el virus recombinante 1 (denominado R1 gC-) el 63% del genoma es homólogo a BoHV-5 (desde el nt 58000 al 140000), mientras que en el virus recombinante 2 (R2 gI-) el 86% del genoma es homólogo a BoHV-1 (desde el nt 22600 al 140000). En cuanto al sitio de recombinación, el virus R1 gC- se originó por un evento entre los nt 55182-55226 basados en la secuencia de BoHV-1 o nt 56449-56493 basados en BoHV-5, correspondientes a la región 3´ del gen UL28. Por su parte, la recombinación en el virus R2 gI-, ocurrió dentro del gen UL43, entre los nt 18796-18837 basado en BoHV-1 o nt 19648-19689 basado en BoHV-5. La estrategia de mapeo genómico diseñada y utilizada en este trabajo permitió caracterizar el background genético de los virus R1 gC- y R2 gI-, siendo sus genomas mayoritariamente homólogos a BoHV-5 y BoHV-1, respectivamente. Además, fue posible identificar la posición genómica exacta donde ocurrió la recombinación, determinándose que los eventos de recombinación tuvieron lugar en sitios diferentes del genoma. La metodología desarrollada en este trabajo constituye una herramienta para estudiar la identidad de la progenie viral obtenida tanto en ensayos de coinfección in vitro o in vivo con distintas cepas de BoHV-1 y BoHV-5, como en cepas virales aisladas de campo donde estos virus coexisten. De esta manera, se contará con información más certera sobre la frecuencia de ocurrencia de recombinación entre BoHV-1 y BoHV-5.