DESARROLLO DE UN ELISA DE INHIBICIÓN COMPETITIVO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA BRUCELOSIS EN BOVINOS, RESULTADOS PRELIMINARES

MARÍA BELÉN NOVOA; AGUIRRE, NERINA PATRICIA; SUSANA TORIONI DE ECHAIDE; BEATRIZ VALENTINI; VANZINI, VICTOR RENÉ

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Congreso; Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorios de Diagnóstico XXIII Reunión Científico Técnica; 2021

Asociación Argentina de Veterinarios de Laboratorio de Diagnóstico

Introducción. La brucelosis es una enfermedad infecciosa zoonótica de relevancia mundial, causada por bacterias del género Brucella que provoca desórdenes reproductivos en animales. En bovinos es causada principalmente por Brucella abortus. En Argentina, la proporción de rodeos de cría y mixtos con brucelosis en la zona de mayor producción bovina es del 12,4%, mientras que para rodeos lecheros de la cuenca de Santa Fe se ha reportado el 2,2%. Las herramientas para el control de la enfermedad se basan en la vacunación, detección y segregación de animales infectados. Las técnicas de diagnóstico serológico oficiales incluyen como tamiz la prueba del antígeno tamponado en placa (BPA) en muestras de suero sanguíneo y la de ELISA indirecto en muestras de leche. Las pruebas de seroaglutinación en tubo (SAT) y 2-mercaptoetanol (2-ME) en paralelo, polarización fluorescente (FPA) y ELISA de inhibición competitiva (ELISAc) se utilizan como pruebas confirmatorias y la fijación del complemento (FC) como prueba de referencia, todas en muestras de suero sanguíneo. En Argentina se dispone de un ELISAc validado para la detección de anticuerpos anti-B. abortus, basado en reactivos importados que no se consiguen comercialmente. El objetivo de este trabajo fue validar un ELISAc para detección de anticuerpos anti-B. abortus en muestras de suero sanguíneo basado en reactivos producidos en la EEA Rafaela-INTA (ELISAcRAFAELA).Materiales y métodos. El antígeno lipopolisacarido liso (sLPS) de B. abortus cepa 1119-3 y el anticuerpo monoclonal (AcM) anti-sLPS (AcM D7) se produjeron previamente en la EEA Rafaela-INTA. El ELISAcRAFAELA utiliza como antígeno al sLPS inmovilizado en una placa de poliestireno. Los sueros problema y controles se agregaron en una dilución 1/10 en buffer PBS + EDTA/EGTA 0,075 M. Luego se añadió el AcM D7 en una dilución 1/1000 en buffer PBS + EDTA/EGTA 0,075M, seguido de un anticuerpo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa en una dilución 1/3000 en PBS + 0,05% tween-20. Se utilizó ABTS como sustrato cromógeno. En cada paso se realizó una incubación de 30 minutos a 25 °C y luego 3 lavados con buffer PBS + 0,05% tween-20. Cada placa de ELISA incluyó sueros control positivo fuerte (C++), débil (C+), negativo (C-) y un control de conjugado (Cc) sin suero. Se realizó una lectura dinámica estandarizada para cuando el Cc alcanzara una DO=1 (± 20%) a los 10 minutos (± 20%) de agregado el ABTS. Los resultados se expresaron en porcentaje de inhibición (%I) respecto al control de conjugado, según la siguiente formula: %I = 100 ? (DOmuestra x 100) / DOCc. Para evaluar el ELISAcRAFAELA desarrollado, se utilizaron muestras de suero sanguíneo de 458 bovinos. Las muestras de suero sanguíneo negativas se obtuvieron de vacas (n = 299) mayores a 3 años de edad vacunadas con la vacuna de B. abortus C19 entre los 3 y 8 meses de edad, pertenecientes a un establecimiento lechero libre de brucelosis en los últimos 10 años. Las muestras de sangre positivas se obtuvieron de vacas infectadas (n = 159) de otro establecimiento lechero con antecedentes de brucelosis (presencia de abortos y aislamiento bacteriológico). Todas las muestras de suero fueron analizadas por duplicado mediante ELISAcRAFAELA y FC. Los resultados obtenidos por ELISAcRAFAELA se analizaron a través de una curva ROC utilizando el programa Medcalc. Se determinó el área bajo la curva (ABC), el punto de corte óptimo (PC) y la sensibilidad (Se) y especificidad (Es) relativas a la FC con un 95% de confianza. Se evaluó la concordancia y el índice kappa (κ) entre el ELISAcRAFAELA y la FC.Resultados. El ELISAcRAFAELA mostró un ABC = 0,999 (95% IC = 0,991 ? 1,000). El PC fue ≥ 40 %I con una Se de 99,4% (95% CI = 96,4?100,0) y una Es de 100,0% (95% IC = 98,9? 100,0), relativas a la FC. La concordancia entre ELISAcRAFAELA y la FC fue de 100,0 % con κ = 1,00.