Transposición de ADN a nivel de molécula única

FERNANDEZ, MARICRUZ; HALLET, BERNARD; ALSTEENS DAVID

Buenos Aires (online)

Jornada; II Jornada de Jóvenes Bionanocientíficos; 2020

JoBioN

Los elementos transponibles o "transposones" agrupan una amplia diversidad de elementos genéticos que pueden propagarse de un lugar a otro dentro del genoma de su huésped1. Este movimiento está mediado por enzimas de recombinación especializadas denominadas "transposasas" que utilizan diferentes químicos para cortar y volver a sellar las moléculas de ADN1,2. El transposón bacteriano Tn4430 perteneciente a la familia Tn3 es conocido por su prevalencia en la diseminación de resistencias a antibióticos entre patógenos. La efectividad de los transposones depende en gran medida de su mecanismo replicativo3. Sin embargo, a pesar de su impacto social, los mecanismos moleculares que median y regulan la transposición de estos elementos siguen siendo poco conocidos3. Por primera vez, los pasos críticos de la reacción de transposición de Tn4430 se reconstituyeron in vitro, revelando una ruta única para el ensamblaje y activación del complejo de transposición. Esta vía está respaldada por estructuras recientes de Cryo-EM4. El objetivo de este proyecto es descifrar la dinámica del ensamblaje del complejo de transposición a nivel de molécula única utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM). El escaneo mediante AFM se está utilizando para visualizar intermediarios claves de la ruta de transposición. Mientras que, la espectroscopía de fuerza de molécula única basada en AFM se utiliza para medir los parámetros termodinámicos y cinéticos del ensamblaje del complejo de transposición y para sondear los cambios conformacionales que tienen lugar durante el proceso5. Hasta el momento se han construido sustratos superenrollados que llevan un Mini-Tn4430 y se han desarrollado y optimizado las condiciones para lograr el 100% de la actividad de escisión con dos mutantes hiperactivos, TnpAS911R y TnpA3X. Estas condiciones ahora se están usando para comparar las actividades de TnpAWT, TnpAS911R y TnpA3X en diferentes sustratos como por ejemplo, moléculas de ADN superenrolladas o lineales que contienen un extremo del transposón para así determinar cómo la topología del ADN afecta a la escisión del mismo. Mientras tanto, estas reacciones han sido examinadas en aire y en líquido empleando AFM en modo Peak-force, lo cual reveló la presencia de complejos TnpAADN. Por otra parte el sustrato de extremo único del transposón se ha ensamblado y unido con éxito a superficies de oro mediante la química de click, y TnpA purificada se ha injertado con éxito en las puntas de AFM empleando conectores PEG-NTA que interaccionan con la etiqueta His-tag(6 histidina) presente en la proteína. Los experimentos de interacción dieron curvas de fuerza-distancia típicas y reproducibles que son sensibles a sustratos de ADN que compiten por TnpA. Por lo tanto, los datos muestran que la configuración experimental es operativa, lo que permite medir interacciones específicas entre TnpA y el extremo de Tn4430. El análisis de las curvas reveló que la mayoría de las interacciones eran monomoleculares (una molécula de TnpA y un extremo del transposón) con una fuerza promedio de alrededor de 67 pN, mientras que una subpoblación de interacciones probablemente se deba a interacciones múltiples de aproximadamente el doble de intensidad. Por lo tanto, el enfoque está listo para comparar la dinámica de interacción de TnpAWT y las variantes hiperactivas TnpAS911R y TnpA3X en sustratos de ADN conteniendo un extremo del transposon. El presente estudio pretende proporcionar una vista detallada sin precedentes que describa cómo el complejo de transposición se ensambla y se activa para catalizar el proceso de transposición.