La espectroscopía de fuerza basada en AFM revela la formación gradual de un complejo de transposición de ADN

FERNANDEZ, MARICRUZ; HALLET, BERNARD; ALSTEENS DAVID

Congreso; XXI Encuentro de Superficies y Materiales Nanoestructurados; 2022

Encuentro Nano

El transposón Tn4430 pertenece a una amplia familia de transposones bacterianos, la familia Tn3, desempeñaun papel predominante en la diseminación de la resistencia a los antibióticos entre los patógenos. A pesar deesto, los mecanismos moleculares que controlan la movilidad de estoselementos aún son poco conocidos. Aquí, usamos microscopía de fuerzaatómica (AFM) basada en curvas de fuerza-distancia (FD) para sondear launión de la transposasa (TnpA) a moléculas de ADN que contienen una o dosrepeticiones invertidas (IR) terminales del transposón a nivel de una solapartícula (Fig.1). Extrajimos la cinética y la termodinámica de lasinteracciones TnpA-ADN y probamos los cambios conformacionales quetienen lugar durante la formación del complejo de transposición. El análisisreveló que la mayoría de las interacciones eran monomoleculares, es decir,entre una molécula de TnpA y un extremo IR formando un complejo deextremo único (SEC) con parámetros cinéticos y termodinámicos bastantesimilares para TnpAWT y dos mutantes hiperactivos. La fuerza de interacciónmedida (~45 pN) y el kon deducido (~ 3 a 4 x 105 M-1 s-1) son típicos deasociaciones bimoleculares específicas de alta afinidad. Sin embargo, la SECparece ser un intermediario metaestable del ensamblaje del transpososoma,con un tiempo de vida estimado τ comprendido entre 5 s para TnpAWT y 10 spara los mutantes hiperactivos. El koff dos veces menor medido para losmutantes en comparación con TnpAWT (es decir, 0,1 s-1 frente a 0,2 s-1)sugiere que los mutantes hiperactivos tienen una mayor propensión aadoptar un estado de transición. Finalmente, en experimentos realizadoscon sustratos de ADN que contenían dos extremos IR como ocurre en eltransposón nativo, se observó otra población con una fuerza de interacciónde ~120 pN. Aquí, se cree que una sola molécula de TnpA une dos extremosIR del sustrato, formando un complejo de extremos emparejados (PEC). La cinetica mostró que la formaciónde PEC ocurre a un ritmo mucho más rápido en el caso de mutantes hiperactivos que con TnpAWT. Nuestroshallazgos sugieren una vía escalonada para la formación y activación del complejo de transposición durante lacual TnpA primero se une a un solo extremo del transposón y luego experimenta una transición estructuralque le permite unirse al segundo extremo de manera cooperativa y activarse para la catálisis de transposición.Los hallazgos proporcionan nuevos conocimientos cuantitativos sobre la formación del complejo detransposición Tn4430 con una resolución que difícilmente podría alcanzarse utilizando enfoques bioquímicosconvencionales, lo que constituye un estudio pionero en el campo de las transacciones proteína-ADN.