ESTUDIO MOLECULAR DE TRES MUESTRAS PORTADORAS DE FENOTIPO D NEGATIVO C/E POSITIVO

MUFARREGE, NICOLÁS; TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; PRINCIPI, CINTIA; LUJÁN BRAJOVICH, MELINA ELIANA; MATTALONI, STELLA; ENSINCK, MARÍA ALEJANDRA; GARCIA BORRAS, SILVIA; BIONDI, CLAUDIA; COTORRUELO, CARLOS

Rosario

Congreso; XXI Congreso y la XXXIX Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2019

Sociedad de Biología de Rosario

El fenotipo D negativo puede ser causado por diferentes variantes alélicas RHD. Aquellas que originan proteínas RhD que no expresan los epitopes del antígeno D o que no se ensamblan en la membrana eritrocitaria se denominan alelos RHD silentes o nulos. Por otro lado, una expresión mínima del antígeno D es causada por alelos variante DEL. En los estudios inmunohematológicos de rutina los donantes portadores de variantes DEL -debido a su escasa densidad antigénica- son tipificados erróneamente como D negativo, con el riesgo de inducir una aloinmunización en receptores D negativo. Además, se ha reportado que las variantes DEL están asociadas a la expresión de los antígenos C y/o E. El objetivo de este trabajo fue elucidar las bases moleculares de tres muestras con fenotipo D negativo C/E positivo de donantes que concurrieron al Laboratorio de Inmunohematología de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas de la Universidad Nacional de Rosario. Se utilizaron técnicas de hemaglutinación en tubo para la determinación del fenotipo Rh completo. El estudio del antígeno D fue realizado utilizando un anticuerpo monoclonal blend IgM e IgG (clones TH28/MS26). La tipificación de los antígenos C, c, E y e se llevó a cabo con los siguientes anticuerpos monoclonales específicos: anti-C (clon MS24), anti-c (clon MS33), anti-E (clon MS260) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63), respectivamente. El ADN genómico de dichas muestras fue obtenido a través de un método de salting-out modificado. En todas las muestras se investigó la presencia de fragmentos del gen RHD a través de una estrategia de PCR multiplex. En aquellas muestras D-/RHD+ se analizaron los polimorfismos asociados a los 10 exones del gen RHD para identificar alelos híbridos mediante reacciones de PCR alelo específicas. Finalmente, las muestras no caracterizadas fueron estudiadas mediante secuenciación por Next Generation Sequencing (NGS). El fenotipo de dos de las muestras resultó D-, C-, c+, E+, e+, mientras que el de la restante fue D-, C+, c+, E-, e+. La estrategia de PCR multiplex evidenció que las tres muestras D negativas resultaron portadoras de secuencias génicas RHD específicas. Sin embargo, la estrategia de escaneo de exones no permitió la identificación de alelos híbridos en las mismas. El análisis por NGS permitió la detección de tres polimorfismos diferentes en cada una de las muestras analizadas: c.1001T>A (fenotipo ccEe), c.361_371delTTGTCGGTGCT (fenotipo Ccee), c.1228-1G>C (fenotipo ccEe). Los dos primeros provocan sendos corrimientos de los marcos de lectura que generan un codón de terminación de la traducción. El último polimorfismo hallado fue responsable de un cambio nucleotídico en el sitio de corte y empalme. Como resultado, en los tres casos, se produce una proteína RhD truncada que no se inserta en la membrana eritrocitaria. La identificación de los polimorfismos responsables de una expresión nula o disminuida de los epitopes antigénicos D en dadores de sangre considerados serológicamente D negativo evitará la transfusión de unidades DEL a pacientes con riesgo de aloinmunización.