Polimorfismo molecular del locus RHD en fenotipos D negativo C/E positivo

TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; LUJAN BRAJOVICH, MELINA; MUFARREGE, NICOLÁS ; MATTALONI, STELLA MARIS; BIONDI, CLAUDIA; GARCIA BORRAS, SILVIA; COTORRUELO, CARLOS

Rosario

Congreso; XVIII CONGRESO y XXXVI REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO; 2016

Sociedad de Biología de Rosario

Diferentes variantes alélicas RHD son responsables del fenotipo D negativo. Los alelos RHD nulos originan polipéptidos que no expresan epitopes D o no se integran en la membrana eritrocitaria mientras que los alelos DEL codifican proteínas que expresan una escasa cantidad de antígeno D que no es detectada por los métodos inmunohematológicos convencionales. Debido a la dificultad para identificar estos fenotipos en los Bancos de Sangre, la mayoría de los dadores portadores de variantes DEL son tipificados erróneamente como D negativo, con el riesgo de inducir una aloinmunización en receptores D negativo. El objetivo de este trabajo fue estudiar las bases moleculares responsables del fenotipo D negativo en muestras portadoras de fragmentos génicos RHD específicos. Se estudiaron 780 muestras de sangre periférica con fenotipo D negativo portadoras de los antígenos C y/o E. En todas las muestras se investigó la presencia del gen RHD a través de una estrategia de PCR multiplex. En aquellas muestras D-/RHD+ se analizaron polimorfismos asociados a los 10 exones del gen RHD (escaneo de exones) para identificar alelos híbridos mediante reacciones de PCR alelo específicas. Las muestras no caracterizadas fueron estudiadas con técnicas de microarreglos de ADN y secuenciación. Mediante la estrategia de PCR multiplex se detectaron 117 muestras D negativas portadoras de secuencias génicas RHD específicas. El escaneo de exones permitió identificar los siguientes alelos híbridos nulos: RHD-CE(3-9)-D (n=15), RHD-CE-Ds (n=58), RHD-CE(4-8)-D (n=1), RHD-CE(4-9)-D (n=1) y RHD-CE(4-7)-D2 (n=1). Mediante estudios de microarreglos de ADN se detectaron los alelos DEL: RHD(M295I) (n=2) y RHD(IVS3+1G>A) (n=2). Los estudios de secuenciación identificaron las variantes alélicas nulas: RHDψ (n=1), RHD(581insG) (n=11), RHD(1001T>A) (n=1) y rG (n=1) y la variante DEL: RHD(46T>C) (n=7). La caracterización de estas muestras permitió el desarrollo de estrategias de PCR-SSP para la detección de los alelos RHD(581insG) y RHD(46T>C). Utilizando estas técnicas de genotipificación se identificaron 5 variantes RHD(46T>C) y 8 RHD(581insG). Además el diseño de una estrategia de PCR-RFLP para la detección de alelos RHD(M295I) permitió la tipificación de 2 nuevas muestras portadoras de esta variante. El porcentaje de muestras D negativas portadoras de alelos DEL fue del 2,31%, mientras que el porcentaje de muestras portadoras de alelos nulos fue del 12,69%. La alta incidencia de alelos DEL en nuestra población demuestra la importancia de una correcta identificación de los polimorfismos responsables de una expresión disminuida de los epitopes antigénicos D en dadores de sangre considerados serológicamente D negativo. Esto evitará la transfusión de unidades DEL a pacientes con riesgo de aloinmunización.