CARACTERIZACIÓN DEL LOCUS RHD EN UN PACIENTE ALOINMUNIZADO CON ANTI-D

LUJAN BRAJOVICH, MELINA; TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; MATTALONI, STELLA MARIS; MUFARREGE, NICOLÁS; BIONDI, CLAUDIA; COTORRUELO, CARLOS

Rosario

Congreso; XVIII CONGRESO y XXXVI REUNIÓN ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGÍA DE ROSARIO; 2016

Sociedad de Biología de Rosario

El sistema Rh es altamente polimórfico y uno de los más importantes en Medicina Transfusional. El locus RH está constituido por los genes RHD y RHCE. Numerosos alelos RHD son responsables de un fenotipo D variante, caracterizado por una intensidad de aglutinación inferior a la observada en el fenotipo D positivo. Pacientes portadores de estas variantes alélicas deben ser considerados D negativo para transfusiones o embarazos ya que podrían desencadenar una respuesta inmune humoral hacia el antígeno D. El objetivo de este trabajo fue investigar las bases moleculares del locus RHD en un paciente portador de un fenotipo D variante sensibilizado con un aloanticuerpo de especificidad anti-D. La historia clínica del paciente indicaba que había recibido terapia transfusional con dos unidades de concentrado eritrocitario D positivo en marzo de 2016. Se trabajó con una muestra de sangre periférica del paciente. A partir de una suspensión eritrocitaria, se investigó el fenotipo Rh completo por técnicas de hemaglutinación utilizando reactivos monoclonales. Se estudió el antígeno D empleando anti-D IgM/IgG (clones TH28 / MS26), IgM (clon MS201), IgM (clon RUM1) e IgM (clones LDM1 y ESD1M). La expresión de los antígenos C, c, E y e se analizó utilizando anti-C (clon MS24), anti-c (clon MS33), anti-E (clon MS258/MS80) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63). Se obtuvo el ADN genómico a través del método de salting-out. Se utilizaron técnicas de PCR-SSP para detectar alelos D débiles tipo 1, 2, 3 ó 4. Mediante estrategias de PCR alelo específica se analizaron polimorfismos característicos para detectar cada uno de los 10 exones del gen RHD. Finalmente, se secuenciaron los 10 exones según el método de Sanger en electroforesis capilar. Los estudios del antígeno D mostraron intensidades de aglutinación disminuidas (score: 2+) con los 4 reactivos anti-D empleados, comparado con una muestra D positivo normal (score: 4+). El fenotipo Rh completo resultó DvarC-c+E-e+. Las estrategias moleculares no evidenciaron presencia de los alelos D variantes más frecuentes. Los estudios de secuenciación del gen RHD permitieron identificar una mutación puntual localizada en el exón 2. El nucleótido timina (T) ubicado en la posición 161 de la secuencia consenso fue reemplazado por una citosina (C) generando el alelo RHD(161T>C). Esta mutación puntual conduce al cambio del aminoácido leucina (Leu) de la posición 54 por un residuo de prolina (Pro). La inserción de este aminoácido rígido alteraría el plegamiento nativo de la proteína RhD y su integración en el complejo Rh, generando la baja densidad antigénica observada en esta variante. La sustitución Leu54Pro, ubicada en el primer dominio extracitoplasmático, provocaría la pérdida de epitopes D, permitiendo el desarrollo de aloanticuerpos anti-D dirigidos contra los epitopes ausentes luego de la transfusión de unidades D positivas. Estos hallazgos demuestran la importancia de considerar D negativo a los pacientes cuyos glóbulos rojos reaccionan débilmente con el reactivo anti-D. Nuestros resultados muestran que los estudios moleculares del locus RH son un complemento necesario en Medicina Transfusional para la caracterización de muestras con fenotipo D variante.