Manejo de la paciente embarazada D negativa: determinación prenatal no invasiva del Rh fetal

DI MÓNACO, RENE; TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; CEJAS VERÓNICA; LUJAN BRAJOVICH, MELINA; BIONDI, CLAUDIA; COTORRUELO, CARLOS

Córdoba

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Ginecología y Obstetricia FASGO; 2013

La Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal es causada por anticuerpos maternos dirigidos frecuentemente contra el antígeno D del sistema Rh. El uso generalizado de la profilaxis con inmunoglobulina anti-D ha disminuido considerablemente esta inmunización, sin embargo aproximadamente 1 de cada 700 recién nacidos presenta Enfermedad Hemolítica por incompatibilidad Rh. Las mujeres embarazadas RhD negativas deben recibir una profilaxis con inmunoglobulina anti-D para evitar la formación de aloanticuerpos, siendo incluidas en este tratamiento las gestantes cuyos fetos son RhD negativos.En trabajos anteriores hemos realizado la genotipificación RHD fetal en muestras de ADN obtenidas de células de líquido amniótico por amniocentesis. Sin embargo este procedimiento invasivo presenta riesgos para la continuidad del embarazo y puede aumentar la sensibilización como resultado de hemorragias maternofetales.Durante la gestación, aproximadamente el 3% del ADN libre en plasma materno es de origen fetal posibilitando la determinación del Rh fetal por métodos no invasivos. La genotipificación RHD fetal no invasiva permite no solo realizar el diagnóstico temprano de la Enfermedad Hemolítica Fetoneonatal en embarazadas aloinmunizadas sino también racionalizar la administración prenatal de la inmunoprofilaxis exclusivamente a gestantes RhD negativas no sensibilizadas que portan fetos RhD positivos. El objetivo de este trabajo fue evaluar una estrategia de PCR en tiempo real para la determinación no invasiva del genotipo RHD fetal utilizando plasma materno. Muestras: 10 ml de sangre periférica fueron recogidos en tubos estériles utilizando EDTA como anticoagulante. Las muestras fueron obtenidas de 127 mujeres RhD negativas, con embarazo único (rango de gestación 17 a 27 semanas) que concurrieron al Servicio de Obstetricia del Hospital Provincial del Centenario. Obtención de ADN:: el ADN fue extraído de 800 μL de plasma materno por adsorción en membranas de sílica gel y posterior elución.Genotipificación RHD: El genotipo RHD fetal fue determinado con una estrategia de PCR en tiempo real. Se utilizaron cebadores para amplificar una región del exón 7 y una región del exón 10 del gen RHD y sondas fluorogénicas TaqMan® marcadas con VIC (exón 7) y FAM (exón 10). También se amplificó un fragmento del gen SRY y se utilizó para su detección una sonda marcada con VIC, para confirmar el origen fetal del ADN obtenido. El exón 7 fue amplificado en un sistema de PCR monoplex mientras que se utilizó una PCR duplex para estudiar el exón 10 y el gen SRY. Serología del recién nacido: se determinó el fenotipo RhD en muestras de sangre de cordón por reacciones de hemaglutinación, utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales.La estrategia de PCR en tiempo real desarrollada permite realizar la genotipificación RHD a partir de ADN obtenido del plasma de mujeres embarazadas. La determinación prenatal no invasiva del genotipo RHD fetal contribuye a un mejor abordaje de la embarazada D negativa sensibilizada y no sensibilizada.La genotipificación RHD fetal no invasiva contribuirá a racionalizar el uso de la profilaxis con inmunoglobulina anti-D permitiendo su administración exclusivamente a gestantes de fetos RhD positivos.Cuando todos los estudios moleculares fueron negativos no se pudo confirmar la presencia de ADN fetal.Está previsto el análisis de marcadores epigenéticos para resolver los casos de fetos RhD negativos femeninos y la detección de alelos silentes para mejorar la especificidad.