DESEQUILIBRIO DE LIGAMIENTO ENTRE DOS VARIANTES ALELICAS DE LOS GENES RHD Y RHCE

LUJÁN BRAJOVICH, MELINA ELIANA; TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; MATTALONI, STELLA MARIS; PERCARA, MARÍA LUCRECIA; GARCIA BORRAS, SILVIA; BIONDI, CLAUDIA; COTORRUELO, CARLOS

Rosario

Congreso; XVI Congreso y XXXIV Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2014

Sociedad de Biología de Rosario

El antígeno D es un mosaico de epitopes que se expresan en la proteína RhD del glóbulo rojo. Este polipéptido está codificado por el gen RHD que junto al gen RHCE integran el locus RH. El gen RHCE codifica para la proteína RhCE que expresa los epitopes C, c, E y e. Numerosos alelos RH son responsables de expresiones antigénicas alteradas. El objetivo de este trabajo fue caracterizar a nivel molecular el alelo responsable de una expresión débil del antígeno D y estudiar su segregación familiar. Las muestras con expresión aberrante del antígeno D fueron obtenidas de dos hermanos (H1 y H2) y su padre (PP). También se estudió una muestra obtenida de la madre (MM). Se investigó el fenotipo D por hemaglutinación con 4 reactivos monoclonales anti-D: IgM/IgG (clones TH28 / MS26), IgM (clon MS201), IgM (clon RUM1) e IgM (clones LDM1 y ESD1M). También se estudió el fenotipo Rh con anticuerpos anti-C (clone MS24), anti-c (clone MS33), anti-E (clon MS258/MS80) y anti-e (clones MS16 + MS21 + MS63). Se obtuvo ADN genómico a través del método de salting-out. Se aplicaron técnicas de PCR-SSP para detectar alelos D débiles tipo 1, 2, 3 ó 4 y para escanear los 10 exones del gen RHD. Se secuenciaron por la técnica de Sanger cada uno de los 10 exones de ambos genes RH. Las reacciones de hemaglutinación de H1, H2 y PP con los diferentes reactivos anti-D fueron negativas excepto para el clon RUM1 (IgM) que mostró una reacción débilmente positiva. La muestra MM fue D positiva. El fenotipo Rh completo de H1 y H2 resultó Dvar,C-,c+,E+,e- mientras que para PP fue Dvar,C-,c+,E-,e+ y para MM fue D,C+,c+,E+,e+. Debido al aparente caso de exclusión de la paternidad se investigó el antígeno E en la muestra PP utilizando 2 reactivos monoclonales anti-E IgM (MS260 y MS80). Se observó aglutinación débil con el clon MS260 indicando que el fenotipo Rh de la muestra PP era Dvar,C-,c+,Evar,e+. Los estudios de PCR permitieron descartar los alelos D débil Tipo 1 al 4 y mostraron la presencia de los 10 exones del gen RHD. El análisis de la secuencia del gen RHD permitió identificar una mutación puntual 46T>C en el exón 1 responsable del cambio Trp16Arg. Por otro lado, en la muestra con expresión alterada del antígeno E se detectaron las mutaciones 697C>G, 712A>G, 733C>G y 744T>C en el exón 5 del alelo RHcE responsables de las sustituciones Gln233Glu, Met238Val y Leu245Val. La mutación 744 no introdujo cambio de aminoácido. El estudio de segregación alélica en el grupo familiar permitió determinar que ambos alelos mutados se encontraban en posición cis. La baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHcE halladas en este estudio sugiere un desequilibrio de ligamiento entre las mismas. La descripción de asociaciones alélicas en cis es útil para la identificación de anticuerpos dirigidos contra antígenos Rh de alta frecuencia y facilitan la compatibilidad transfusional en pacientes con genotipos poco frecuentes. El cambio de aminoácidos hidrofóbicos (Trp) o polares (Gln) por residuos cargados (Arg, Glu) dificultaría el correcto ensamblaje de los polipéptidos Rh en la membrana del eritrocito provocando la expresión alterada del antígeno D y del antígeno E. Nuestros resultados muestran que los estudios moleculares son un complemento necesario para la caracterización de muestras con fenotipo Rh variante.