Caracterización molecular de dos variantes alélicas del gen RHD

PERCARA, MARÍA LUCRECIA; TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; GARCIA BORRAS, SILVIA; LUJÁN BRAJOVICH, MELINA ELIANA; COTORRUELO, CARLOS

Zavalla, Santa Fe

Congreso; XV Congreso y XXXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2013

Sociedad de Biología de Rosario

El locus RH está compuesto por dos genes homólogos denominados RHD y RHCE. El gen RHD posee múltiples alelos responsables de expresiones alteradas del antígeno D (variantes D) y alelos nulos presentes en individuos RhD negativos. Actualmente se considera que los pacientes con expresión disminuida de los epitopes D, desarrollan una respuesta inmune luego de la transfusión con unidades RhD positivas. Sin embargo, estudios recientes demostraron que los receptores con variantes D débiles tipo 1, 2 y 3, no producen anticuerpos anti-D. Por otro lado, la presencia de alelos nulos en individuos RhD negativos es responsable de resultados falsos positivos en las estrategias de genotipificación RHD. El objetivo de este trabajo fue caracterizar a nivel molecular dos variantes alélicas del gen RHD. Se estudiaron muestras de sangre periférica de un paciente (P1) que presentó una expresión débil del antígeno D evaluada por hemaglutinación y de un paciente (P2) RhD negativo portador de un alelo RHD detectado por genotipificación. Se determinó el fenotipo Rh completo en suspensiones eritrocitarias mediante técnicas de hemaglutinación utilizando anticuerpos monoclonales anti-D, anti-C, anti-c, anti-E y anti-e. Se obtuvo ADN genómico a través del método de salting-out. Se analizó por una estrategia de PCR multiplex la presencia del gen RHD. En el P1 se investigó la presencia de las variantes alélicas D débiles tipo 1, 2, 3 y 4 y de la variante DVII. Posteriormente, en ambas muestras, se amplificaron por PCR alelo específica cada uno de los diez exones del gen RHD. La muestra del P2, no caracterizada por los métodos anteriores, fue secuenciada. Los estudios moleculares realizados en la muestra del P1 demostraron la ausencia de los exones 7, 8 y 9 del gen RHD sugiriendo que el fenotipo D variante observado es consecuencia de un alelo híbrido RHD(1-6)-CE(7-9)-D(10) en el cual los exones RHD específicos ausentes fueron reemplazados por los homólogos del gen RHCE mediante un fenómeno de recombinación homóloga. Esta variante alélica introduce el cambio de los aminoácidos Asp350His, Gly353Trp, Ala354Asn y Glu398Val en la proteína RhD. Por otro lado, los estudios de secuenciación realizados en la muestra del P2 identificaron una duplicación de 37 pb al comienzo del exón 4 (IVS3-19 dupl 37) y las mutaciones puntuales 609G>A, 654G>C, 667T>G, 674C>T y 807T>G. Esta última genera un codón de terminación de la transcripción prematuro. Las mutaciones halladas en esta última variante fueron compatibles con el alelo RHD ya descripto en muestras rr pero a diferencia de lo reportado en la literatura, la variante hallada en nuestro trabajo fue encontrada en un fenotipo r?r portador del antígeno C. La caracterización molecular de las variantes D del sistema Rh permitirá un mejor manejo de la unidades D negativas y un uso racional de la profilaxis con IgG anti-D. El estudio molecular del locus RH resulta importante para desarrollar estrategias de tipificación de ADN confiables, que permitan realizar la genotipificación RHD prenatal y optimizar la selección de unidades hemocompatibles en los bancos de sangre.