DETECCION DE ADN LIBRE DE DONANTE EN PACIENTES CON TRASPLANTE RENAL

TRUCCO BOGGIONE, CAROLINA; MATTALONI, STELLA MARIS; PRINCIPI, CINTIA; POSNER, VICTORIA; STETTLER, SILVINA; ENSINCK, MARÍA ALEJANDRA; BIONDI, CLAUDIA; COTORRUELO, CARLOS

ROSARIO

Congreso; XXV Congreso y la XLIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2023

Sociedad de Biología de Rosario

El ADN libre (cfDNA) es material genético que se encuentra presente en el plasma circulante y otros fluidos corporales. Se origina principalmente a partir de las células hematopoyéticas por mecanismos de apoptosis, pero también proviene de tejido de órganos sólidos. En pacientes trasplantados, se encuentra también, aunque en menor proporción, ADN libre del donante (dd-cfDNA) proveniente de la lisis y/o recambio de células del injerto. Inicialmente luego de un trasplante, los valores de concentración de dd-cfDNA representan más del 5% del ADN libre total presente en la circulación del receptor. Sin embargo, su concentración decrece rápidamente y es prácticamente indetectable una semana post-trasplante. Se ha demostrado que en situaciones de rechazo, el contenido de las células del injerto se libera a la circulación del receptor, aumentando así los niveles de dd-cfDNA. Se postula que valores de dd-cfDNA superiores al 1% del ADN libre total presente en el plasma del receptor serían indicativos de daño del órgano trasplantado. El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de dd-cfDNA en el plasma de individuos con trasplante de riñón. Se estudiaron cuatro muestras de pacientes femeninas trasplantadas con órganos masculinos. A cada paciente se le realizó una extracción de 20 ml de sangre entera. Se extrajo el ADN libre total de la fracción plasmática utilizando un kit comercial basado en microesferas magnéticas cuya superficie está recubierta con polímeros naturales o sintéticos que presentan una alta afinidad por los ácidos nucleicos. Se analizó la presencia de dd-cfDNA y ADN libre total mediante PCR en tiempo real y PCR digital. Se utilizó como marcador de ADN libre total el gen de la Beta globina Humana (HBB) y el gen marcador de sexo SRY para la identificación del dd-cfDNA. Los fluoróforos de las sondas TaqMan utilizadas, HEX para HBB y FAM para SRY, permitieron estudiar ambos genes en sistemas dúplex. Los estudios de PCR en tiempo real mostraron valores de Ct iguales a 27 para el gen HBB en todos los casos mientras que los valores observados para el marcador SRY fueron iguales a 39 (paciente 1), 42 (paciente 2) y 36 (paciente 3 y 4). Utilizando curvas de calibración se obtuvo el porcentaje que representaba el dd-cfDNA respecto del ADN libre total. Para la paciente 1 fue de 0,12%, para la paciente 2 fue 0,015% mientras que para las pacientes 3 y 4 fue 0,89%. A través de la estrategia de PCR digital se obtuvieron valores absolutos de concentración de ADN libre total y dd-cfDNA presentes en el plasma de cada paciente. Estos datos permitieron calcular qué fracción del ADN libre total estaba representada por el dd-cfDNA en cada caso. Los porcentajes obtenidos fueron 0,37% (paciente 1), 0,21% (paciente 2), 0,67% (paciente 3) y 0,91% (paciente 4). Ambas estrategias permitieron inferir un estado de no rechazo del órgano trasplantado en todos los casos, en concordancia con los informado por los médicos sobre el estado del paciente.