Fosforilación diferencial de la proteína de unión a ácidos nucleicos de pez cebra (zCNBP) durante el desarrollo embrionario

LOMBARDO, VERÓNICA A.; CALCATERRA, NORA B.

Rosario, Santa Fe, Argentina

Congreso; VI Congreso y XXIV Reunión anual de la Sociedad de Biología de Rosario (SBR).; 2004

Sociedad de Biología de rosario (SBR)

La proteína de unión a ácidos nucleicos (CNBP) se encuentra altamente distribuida a través del reino animal. Esta proteína muestra una gran conservación de secuencia y organización estructural general, presentando siete nudillos de Zn del tipo retroviral CCHC, una caja RGG, un sitio putativo de proteólisis y sitios probables de fosforilación. Hasta este momento no se habían realizado estudios de fosforilación de CNBP, por lo que resultó interesante ver si la proteína era capaz de ser fosforilada in vitro y, en el caso de que esto ocurriera, si la fosforilación presentaba un comportamiento diferencial durante el desarrollo embrionario. Para realizar este análisis se estudió la proteína de unión a ácidos nucleicos de pez cebra (zCNBP). zCNBP presenta cuatro sitios putativos de fosforilación, los cuales se encuentran en Ser4, Tyr41, Tyr85 y Tyr145. Se incubó zCNBP fusionada a la enzima glutatión S-transferasa (GST-zCNBP), en presencia de extractos de proteínas totales de embriones en diferentes estadios de desarrollo, ATP no radiactivo y [g 32P] ATP en un medio de reacción apropiado a 30ºC. Posteriormente, la matriz fue lavada, GST-zCNBP eluído, sembrado en un SDS-PAGE y expuesto a una placa radiográfica. Luego del revelado, el gel fue teñido con Azul de Coomassie, digitalizado, las bandas cortadas y las cpm medidas en contador de centellero líquido. Una vez puestas a punto las condiciones de reacción de fosforilación, se procedió a analizar si la misma tenía un comportamiento diferencial durante el desarrollo embrionario y primeras etapas después de la eclosión de pez cebra. Para esto, se realizaron reacciones de fosforilación de GST-zCNBP en presencia de extractos de proteínas totales correspondientes a distintos estadios tempranos (8 células, 256 células, 512 células, 100% epibolia), intermedios (8 somitos, 13 somitos, 17 somitos, 21 somitos, 26 somitos) y tardíos (24 hpf -horas post fecundación-, 36 hpf, 48 hpf, 72 hpf, 96 hpf y 120hpf) de desarrollo embrionario.  De los resultados obtenidos se puede concluir que GST-zCNBP es fosforilada in vitro. El nivel de fosforilación es constante durante los primeros estadios de desarrollo (desde 8 células hasta 26 somitos), alcanzando un valor máximo entre las 24 hpf y las 48 hpf, a partir del cual disminuye. También se pudo observar que zCNBP sufre una proteólisis diferencial durante el desarrollo embrionario, probablemente entre el primer y segundo nudillo de Zn, cuyo comienzo coincide con el momento en el que empieza a aumentar la señal de fosforilación (24hpf), sugiriendo una relación entre ambos fenómenos. Además, hemos observado que cuando CNBP es proteolizada, el extremo amino terminal  de 29 aminoácidos fusionado a GST conserva la marca radioactiva. Siendo que entre los primeros 29 residuos el único sitio probable de fosforilación es Ser4, estos resultados sugieren que este aminoácido es fosforilado y que la quinasa involucrada en esta fosforilación podría ser la caseína quinasa 2 (CK2).