Desarrollo de un nuevo test, tipo "point of care" (poc), para el diagnóstico molecular del Chagas en neonatos

CARRILLO C; LAROCCA L; STOLOWICS FG; VOJNOV A

Córdoba

Mesa redonda; XV Jornadas Argentinas de Microbiología - Adelantos tecnológicos en el diagnóstico microbiológico; 2014

Asociación Argentina de Microbiología

La enfermedad de Chagas es una endemia originalmente americana, con al menos 10 millones de personas infectadas. Las terapias para tratar el Chagas son relativamente efectivas en la fase aguda de la enfermedad y en los casos infantiles; aumentando la probabilidad de cura cuanto más precoz sea el diagnóstico. Existen diversos métodos de diagnóstico serológico para Chagas en adultos/as e infantes; sin embargo no son aplicables en neonatos/as a causa de la presencia de anticuerpos maternos circulantes. Por otro lado, la detección del parásito por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y sus variantes, resulta muy sensible y específica pero requiere de una infraestructura, equipamiento y recursos humanos complejos por lo que se restringe a pocos centros de salud o investigación. Para asegurar el diagnóstico de Chagas congénito, el Ministerio de Salud argentino junto a Unicef han diseñado un algoritmo para neonatos/as en tres pasos: 1- al momento del nacimiento, por observación del parásito en sangre (sensibilidad ~50% muy dependiente del/a operador/a); 2- a los ~6 meses, con el mismo procedimiento; 3- a partir de los 9 meses de edad, por métodos serológicos (89-94% de sensibilidad), donde los anticuerpos circulantes maternos ya no interfieren con el resultado de la prueba. La aplicación del algoritmo implica que al menos la mitad de los casos de Chagas congénito no son confirmados hasta pasados los 9 meses de edad, perdiéndose un valioso tiempo para el tratamiento precoz. Un riesgo adicional, es la inconcurrencia de los/as pacientes al control, perdiéndose la posibilidad de completar su diagnóstico e iniciar el tratamiento. Nuestro OBJETIVO consistió en diseñar un método de diagnóstico, sensible y específico y a la vez simple e inclusivo (para todo tipo de condición) que permita el tratamiento precoz de la enfermedad. Para ello seleccionamos una plataforma tecnológica de amplificación molecular isotérmica, aplicada con éxito en diversos países para detectar diferentes agentes infecciosos. El desarrollo del test para Chagas incluyó 3 etapas: -ETAPA 1: Selección de secuencias blanco y diseño de primers, mediante análisis bioinformático y aplicando un software específico para esta tecnología. - ETAPA 2: Puesta a punto de la reacción in vitro. Se efectuaron pruebas para ajustar: a- las condiciones de reacción; b- la sensibilidad en diversos tipos de muestra dispensadas en distintos soportes; y c- la especificidad, utilizando distintas cepas de T. cruzi, otros parásitos filogenéticamente emparentados, células humanas y células no relacionadas al parásito ni al hospedador. Adicionalmente se realizaron estudios en muestras de sangre positivas y negativas para Chagas certificadas por el Instituto Nacional de Parasitología ?Dr. Mario Fatala Chaben?. - ETAPA 3: Adecuación de la técnica a condiciones POC, obteniendo un test apto para todo tipo de condición (de equipamiento, infraestructura, de recursos humanos). Para ello, trabajamos en dos puntos clave: la obtención del templado molecular a partir de una muestra de sangre y el método de lectura. El resultado de este desarrollo consistió en un test que incluye los siguientes pasos: ? Obtener la muestra: una gota de sangre obtenida mediante punción, seca en un disco de papel es suficiente (no se requiere extraccionista). ? Sembrar la muestra en la mezcla de reacción. ? Incubar 40 minutos a 65°C (en cualquier tipo de dispositivo o baño térmico). ? Revelar el resultado, mediante el sistema de tiras reactivas ?lateral flow lipsticks? (LFD), similar a los tests de embarazo comerciales. Esta experiencia nos anima a proponer próximos desarrollos para otras enfermedades infecciosas.