Inmunización contra Staphylococcus aureus: obtención y evaluación de un conjugado a polisacárido capsular

BARBAGELATA MS; MARELLI B.; MARCIPAR I.

Buenos Aires

Congreso; Reunión Científica de la Asociación Argentina de Microbiología.; 2003

Asociación Argentina de Microbiología.

El Staphylococcus aureus es la principal causa de mastitis en vacas, lo que genera grandes pérdidas económicas. Las infecciones intramamarias causadas por esta bacteria tienden a volverse crónicas y las posibilidades de cura luego de una terapia con antibióticos es limitada. Existen evidencias de la presencia de una cápsula de polisacáridos que actúa como factor de virulencia y como antígeno protector del S. aureus, esta cápsula permite el acceso de anticuerpos a la pared celular pero enmascara el reconocimiento de anticuerpos por PMN. Los polisacáridos capsulares son antígenos T-independientes muy pocos inmunogénicos, incapaces de estimular una memoria inmunológica. La conjugación de los polisacáridos capsulares con una proteína portadora conduce al aumento de la inmunogenicidad de los mismos. Se aisló una cepa de S. aureus a partir de muestras de leche proveniente de animales con mastitis de la cuenca lechera santafesina. Se extrajeron los polisacáridos capsulares por tratamiento alcalino y posterior purificación por tamiz molecular utilizando para tal fin membranas de ultrafiltración. Luego fueron conjugados a la proteína TcP2βNt-TcCCt por el método de Wilson y Nakane. El conjugado obtenido se purificó por PAGE preparativa y posterior elución del gel con una solución Tris-ClH 0.1 M, pH=8, SDS 0.1%. Mediante ensayos de PAGE y de Western Blot se determinó la pureza del conjugado. Se utilizaron grupos de 5 ratones para cada condición a ser evaluada. Los animales fueron inoculados intraperitonealmente en los días 0, 14, 28 y 42 con las correspondientes dosis de muestra por grupo (tabla 1). Se tomaron muestras de sangre de cada ratón en el momento previo a la primera inoculación y 7 días después de cada inmunización. La respuesta inmune humoral fue evaluada por ELISA y los resultados expresados como la media de las densidades ópticas de cada muestra divididas por un control positivo. Para el análisis comparativo de la respuesta de anticuerpos a lo largo del tiempo en cada grupo de ratones se utilizó un diseño estadístico para mediciones repetidas seguidos por el test de Dunnett para comparaciones de los diferentes grupos con el grupo control. Para evaluar la respuesta humoral desarrollada en cada tiempo por los diferentes grupos de ratones con respecto al grupo control se utilizó el test de Kruskall Wallis seguido del test de Dunn. Conclusiones:  El conjugado puro inoculado generó la respuesta de anticuerpos anticapsulares de mayor magnitud y en menor tiempo que la desarrollada por el polisacárido no conjugado. Los liposomas no provocaron una mejora en la respuesta de anticuerpos anticapsulares tanto para el polisacárido como para el conjugado.S. aureus, esta cápsula permite el acceso de anticuerpos a la pared celular pero enmascara el reconocimiento de anticuerpos por PMN. Los polisacáridos capsulares son antígenos T-independientes muy pocos inmunogénicos, incapaces de estimular una memoria inmunológica. La conjugación de los polisacáridos capsulares con una proteína portadora conduce al aumento de la inmunogenicidad de los mismos. Se aisló una cepa de S. aureus a partir de muestras de leche proveniente de animales con mastitis de la cuenca lechera santafesina. Se extrajeron los polisacáridos capsulares por tratamiento alcalino y posterior purificación por tamiz molecular utilizando para tal fin membranas de ultrafiltración. Luego fueron conjugados a la proteína TcP2βNt-TcCCt por el método de Wilson y Nakane. El conjugado obtenido se purificó por PAGE preparativa y posterior elución del gel con una solución Tris-ClH 0.1 M, pH=8, SDS 0.1%. Mediante ensayos de PAGE y de Western Blot se determinó la pureza del conjugado. Se utilizaron grupos de 5 ratones para cada condición a ser evaluada. Los animales fueron inoculados intraperitonealmente en los días 0, 14, 28 y 42 con las correspondientes dosis de muestra por grupo (tabla 1). Se tomaron muestras de sangre de cada ratón en el momento previo a la primera inoculación y 7 días después de cada inmunización. La respuesta inmune humoral fue evaluada por ELISA y los resultados expresados como la media de las densidades ópticas de cada muestra divididas por un control positivo. Para el análisis comparativo de la respuesta de anticuerpos a lo largo del tiempo en cada grupo de ratones se utilizó un diseño estadístico para mediciones repetidas seguidos por el test de Dunnett para comparaciones de los diferentes grupos con el grupo control. Para evaluar la respuesta humoral desarrollada en cada tiempo por los diferentes grupos de ratones con respecto al grupo control se utilizó el test de Kruskall Wallis seguido del test de Dunn. Conclusiones:  El conjugado puro inoculado generó la respuesta de anticuerpos anticapsulares de mayor magnitud y en menor tiempo que la desarrollada por el polisacárido no conjugado. Los liposomas no provocaron una mejora en la respuesta de anticuerpos anticapsulares tanto para el polisacárido como para el conjugado.