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De acuerdo a datos provistos por la Organización Mundial de la Salud (WHO), el cáncer representa la causa principal de muerte a nivel mundial, alcanzando un 12,5% anual y estimándose que en el año 2020 se producirán 16 millones de nuevos casos anuales (Borwandhar et al., 2012). Actualmente, existen diferentes terapias utilizadas para su tratamiento, así como otras en desarrollo, basadas en cirugía, radiación, quimioterapia, terapia con drogas dirigidas e inmunoterapia. La quimioterapia, a pesar de ser una de las más aplicadas, posee numerosas limitaciones y efectos colaterales, principalmente asociados a la falta de selectividad hacia la célula blanco, lo que genera que muchos tejidos sanos sean afectados por la droga (Singh, 2008). En este contexto permanentemente se avanza en el desarrollo de nuevas drogas.Para registrar una nueva formulación oncológica, inicialmente se deberá evaluar su actividad biológica y estabilidad en cultivos celulares y órganos aislados, para luego comprobar el efecto terapéutico en diversos modelos animales experimentales demostrando su inocuidad y eficacia. La finalidad de estas pruebas en las etapas tempranas del desarrollo de nuevas formulaciones consiste en analizar si la toxicidad del nuevo producto es mayor a la esperada o si, por el contrario, carece de los efectos esperados sobre poblaciones celulares específicas. Además, brindan una herramienta fundamental para determinar que líneas de células normales y tumorales son sensibles para luego estudiar la actividad de nuevas drogas en ensayos in vivo, permitiendo optimizar las diferentes etapas de la investigación traslacional.En este sentido, las pruebas in vitro son fundamentales e indispensables para el desarrollo de nuevos fármacos y se han ido perfeccionando y complejizando a través de los años. Sin embargo, el desarrollo de nanofármacos ha planteado nuevos desafíos ya que muchas de estas moléculas utilizadas como transportadores no responden a los modelos clásicos de estudio (Eaton et al., 2011; Biswas et al., 2012).OBJETIVOSComo objetivo general se propone poner a punto el método del XTT para realizar el estudio preclínico in vitro de nuevas formulaciones oncológicas basadas en el uso de nanotransportadores, utilizando como referencia una formulación comercial de un quimioterápico.METODOLOGÍALínea celular HepG-2:Para los ensayos in vitro se utilizó la línea celular de hepatocarcinoma humano HepG-2, determinando las condiciones óptimas de cultivo y la cinética de crecimiento.Las células fueron crecidas en frascos de cultivo T25 (Nunc Thermo Fisher Scientific, USA) a 37ºC en estufa de cultivo (NUAIRE, modelo UN 4750E, USA) con atmósfera controlada y 5% de CO2. El medio de cultivo utilizado fue Medio Esencial Mínimo modificado por Dulbecco: mezcla de nutrientes F12 (DMEM:F12) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%, glutamina 2 mM y antibióticos-antimicóticos (Invitrogen, USA). Para realizar los pasajes celulares y los ensayos, las células fueron lavadas con PBS y cosechadas luego del tratamiento con tripsina/EDTA (Invitrogen, USA). La cantidad de células a sembrar fue estimada mediante recuento en cámara de Neubauer calculando la viabilidad celular por medio de la coloración con Azul de Tripan (Bouquet et al., 2008).Ensayos de citotoxicidad:Para el desarrollo y validación de los ensayos de citotoxicidad se utilizó la formulación comercial de referencia Taxotere, un fármaco quimioterápico que se clasifica como un "alcaloide vegetal", "taxano" y "agente antimicrotubular?. El principio activo que contiene es el Docetaxel, una droga que interfiere con el ciclo celular al evitar la polimerización de la tubulina.Para analizar la capacidad del método para detectar cambios en la viabilidad celular se analizaron al menos 10 concentraciones de docetaxel en el rango de 0.01 a 10 g/ml.Las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos (Nunc Thermo Fisher Scientific, USA) a una densidad celular de 1x105 células/ml. Luego de 24 h de incubación se descartaron 10 l del medio de cultivo y se reemplazaron por 10 l de la formulación Taxotere a la concentración final requerida. Como control negativo del ensayo se mantuvieron pocillos de células con el medio de crecimiento DMEM:F12 (sin el agregado de formulaciones oncológicas). A continuación, las placas fueron cultivadas durante 1, 3, 6, 12, 24 y 48 h con el fin de determinar el período de tiempo óptimo de exposición a las formulaciones oncológicas para evaluar la citotoxicidad.Una vez establecido dicho parámetro se analizaron nuevas formulaciones antineoplásicas, cuyos datos son confidenciales por tratarse de un proyecto de transferencia tecnológica, con contratos de confidencialidad y propiedad intelectual vigentes.Ensayo XTT: Para cuantificar la citotoxicidad luego de la incubación de las células HepG-2 con las formulaciones en estudio, se agregaron a cada pocillo 25 ul del reactivo XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide) (Biotium, USA) preparado según las indicaciones del fabricante. método permite determinar la viabilidad celular como una función del potencial redox de las células vivas. Dicha población celular es capaz de convertir al XTT en una sal de formazán soluble de color naranja. Las placas fueron incubadas a 37ºC y el desarrollo de color fue evaluado luego de las 3 h, leyendo la densidad óptica a 500 y 690 nm en un lector de microplacas BMG, modelo Spectrostar Nano (BMG, Alemania). El porcentaje de viabilidad celular fue calculado en función del control negativo. La actividad citotóxica fue expresada como dicho porcentaje determinado a partir de la siguiente ecuación:Viabilidad celular (%) = (Absorbancia de los cultivos tratados / Absorbancia de los cultivos controles)  100RESULTADOSEn la figura 1 se muestran los resultados de un ensayo de viabilidad donde se analiza una formulación de referencia (Docetaxel) versus tres nuevas formulaciones, utilizando como referencia células cultivadas en DMEM:F12 sin el agregado de las formulaciones oncológicas. Aquí se evidencia como las concentraciones más altas de las formulaciones quimioterápicas inhiben el crecimiento celular, dando como resultado porcentajes menores de viabilidad.Figura 1: Ensayo de viabilidad celular. Comparación de tres nuevas formulaciones frente a un control negativo (células crecidas en DMEM:F12) y un control positivo (células crecidas en presencia de Docetaxel).CONCLUSIONESEn base a los resultados obtenidos podemos concluir que fue posible validar el método del XTT para su uso en la evaluación preclínica in vitro de nuevas formulaciones quimioterápicas. Además, el ensayo puesto a punto es aplicable para la determinación de una posible relación entre dosis de drogas conocidas y otras en desarrollo, permitiendo ajustar las dosis de inicio en las fases siguientes de evaluación de eficacia.REFERENCIASBiswas, S., Dodwadkar, N.S., Deshpande, P.P., Torchilin, V.P. 2012. Liposomes loaded with paclitaxel and modified with novel triphenylphosphonium-PEG-Pe conjugate possess low toxicity, target mitochondria and demonstrate enhanced antitumor effects in vitro and in vivo. Journal of Controlled Release, 159, 393-402.Borwandkar, V.G., Gonarkar, A., Kamble, M.S., Bhosale, A.V., Choudhari, P.D. 2012. A review on nanopharmaceuticals in cancer therapy. International Journal of Review in Life Sciences, 2, 32-40.Bouquet, W., Boterberg, T., Ceelen, W., Pattyn, P., Peeters, M., Bracke, M., Remon, J.P., Vervaet, C. 2009. In vitro cytotoxicity of paclitaxel/beta-cyclodextrin complexes for HIPEC. International Journal of Pharmaceutics, 367,148-154.Eaton, M.A.W. 2011. How do we develop nanopharmaceuticals under open innovation? Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, 7,371-375.Singh, O.P., Nehru, R.M. 2008. Nanotechnology and cancer treatment. Asian Journal of Experimental Sciences, 22, 45-50.

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