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La proliferación de las células dela granulosa desempeña un rol determinante en la foliculogénesis. Lasgonadotropinas y los estrógenos son los principales moduladores del crecimientocelular durante el periodo preovulatorio1. El cultivo de células degranulosa bovina ha sido ampliamente utilizado desarrollándose diferentes sistemasin vitro para la evaluación de laregulación fisiológica del crecimiento folicular y la ovulación, entre otrosprocesos2. Las células de la granulosa bovina son capaces deproliferar in vitro en presencia dediferentes factores de crecimiento y en presencia o ausencia de suero fetalbovino. En este sentido, una combinación adecuada de factores de crecimiento yhormonas serían suficientes para promover a las células a ingresar a la fase desíntesis (S) de ciclo celular1.Debido a la necesidad de evaluar larespuesta de dichas células frente a diferentes estímulos hormonales o analizardiversos componentes intracelulares que no pueden ser estudiados in vivo dado la complejidad de lossistemas, en este trabajo nos propusimos optimizar el cultivo primario de lascélulas de la granulosa a partir de folículos ováricos bovinos.Paraello, se realizaron ensayos con muestras de ovarios obtenidas en playa de faenaprovenientes de animales sin signos aparentes de trastornos reproductivos quefueron transportadas al laboratorio en solución fisiológica a 35ºC. Una vez allí,los ovarios fueron lavados con solución fisiológica previamente acondicionadaen baño termostático a 35°C. Se seleccionaron folículos con diámetro mayor a8mm provenientes de ovarios sin alteraciones macroscópicas visibles y serealizaron diferentes pooles de 6 folículos como máximo. Se realizó la punciónde dichos folículos con agujas 21G y se extrajo el líquido folicular que fuealmacenado a -80°C para su posterior análisis hormonal. Se realizaron lavadossuaves con buffer fosfato salino (PBS) estéril suplementado con antibiótico-antimicótico(penicilina- streptomicina- anfoterinica- fungizona, Gibco), para desprenderlas células de la granulosa. El producto del lavado fue centrifugado por 5 minutosa 500g. Se descartó el sobrenadante yel pellet de células fue lavado con PBS estéril y centrifugado en las mismascondiciones. A continuación, se procedió a la eliminación de los eritrocitosmediante el uso de un buffer de lisis (EDTA-Na2 0,1mM, NH4Cl0,15M, KHCO3 1mM). Finalmente, las células se resuspendieron en 1mlde medio de cultivo DMEM:F12 (MV) suplementado con albúmina sérica bovina (0,1%,BSA, Felasa), FSH, 1ng/ml, insulina, 0,01ng/ml y antibiótico- antimicótico,0,1%. Se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer utilizando el métodode exclusión del Trypan blue. Paracada ensayo se sembraron 100.000 células viables/pocillo para ensayar lassiguientes condiciones: 1- Control basal (células sin estímulos); 2- Célulasestimuladas con testosterona, 100ng/ml.Luegode incubar durante 48hs a 37°C en atmosfera con 5% CO2, se realizóel estímulo correspondiente y se mantuvieron en las mismas condiciones por 72hs.Una vez que las células llegaron a confluencia, lascélulas sin estímulo, se resuspendieron en el reactivo comercial Trizol (Invitrogen) y se realizó la extracción de ARNsiguiendo las instrucciones del fabricante. Luego se trató con ADNasa y serealizó la transcripción reversa para obtener ADNc. Finalmente se analizaronlos niveles de la enzima citocromo P450 aromatasa (CYP19a1) enzimacaracterística de las células de la granulosa encargada de aromatizarandrógenos, mediante un protocolo optimizado de reacción en cadena de lapolimerasa (PCR). Paralelamente, se evaluó la enzimacitocromo P450 17 hidroxilasa/ 17, 20 liasa (CYP17a1) característica de lascélulas de la teca para descartar contaminación cruzada con esta poblacióncelular. Porotro lado, las células estimuladas con testosterona fueron resuspendidas en unbuffer RIPA para su posterior extracción de proteínas y análisis del receptorde FSH (RFSH) mediante western blot. Para el análisis proteico serealizó una corrida electroforética en un gel desnaturalizante depoliacrilamida al 12%. Las proteínas fueron trasferidas a una membrana denitrocelulosa y luego se realizó el western blot con un anticuerpo policlonal específicoanti-RFSH desarrollado en el Centro de Medicina Comparada (CMC- ICiVet Litoral,UNL-CONICET).Los sobrenadantes de los cultivosse almacenaron a -80°C para futuras determinaciones hormonales.Las células de la granulosa obtenidas en este ensayo mantuvieron suviabilidad y morfología en las condiciones de cultivo establecidas durante eltiempo del ensayo.Los resultados evidenciaron expresión génica de la enzima CYP19a1 entodos los pooles evaluados sin observarse la expresión génica de CYP17a1, queconfirmaría la pureza de la población de células en cultivo. Por otro lado, mediante el ensayo de western blot se evidenció una bandaespecífica de 30KDa de peso molecular correspondiente al RFSH, y cuya expresiónse incrementó en presencia del agente estimulante respecto al control. Estos resultados preliminares indicarían que el método de obtención decélulas de la granulosa a partir de folículos ováricos bovinos podría serutilizado para futuros ensayos que contribuirían a comprender los mecanismosrelacionados a la esteroidogénesis, la ovulación y los procesos relacionados ala funcionalidad ovárica. BIBLIOGRAFÍA1. Colman-Lerner, A.; Salamone, D.; Chiappe, M.E.;Barañao, L. (1995) Comparative Studies Between Freshly Isolated andSpontaneously Immortalized Bovine Granulosa Cells: Protein Secretion, SteroidMetabolism, and Responsiveness to Growth Factors. J Cell Physiol 164:395-403. 2. Gutierrez, C.G., Campbell, B.K., Webb, R. (1997).Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction andmaintenance of estradiol production, response to follicle-stimulating hormone,and morphological characteristics. Biol Reprod 56: 608 ? 616.

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