Desarrollo de una nueva estrategia de clonado a partir del sistema Gateway.

BERTELLI, A; SETTEN, L; NELSON, G; MARCONI, PL; ALVAREZ, MA

Buenos Aires

Congreso; Biolatina 2010; 2010

el presente trabajo describe el desarrollo eficiente de clonación de un fragmento de stADN en el vector de Destino pK7WG2D utilizando el sistema Gateway (Invitrogen). La metodología implica una recombinación directa entre un producto de una amplificación por PCR y el vector de Destino. Este desarrollo permite independendizarse de los factores de selección (generalmente antibióticos) entre los vectores de clonado. MyM: La secuencia de interés codificantes para las enzimas: PMT (putrescine N-methyltransferase de Nicotiana tabacum L.) y H6H (Hyoscyamine 6-hydroxylase de Brugmansia x candida Pers.) fueron clonadas en el vector pCR8(GW)TOPO vector (Invitrogen). A partir de este vector se amplificó cada fragmento por PCR utilizando primers M13 (forward y reverse) para permitir la amplificación de la secuencia de interés más las secuencias de recombinación attl flanqueantes. Finalmente, se procedió a recombinar el fragmento de PCR conteniendo las secuencias attl con el vector Destino utilizando la mezcla enzimática LR Clonase II enzyme MIX (Invitrogen). Cada vector obtenido fue clonado en células competentes de Agrobacterium tumefaciens EHA101. Resultados: La construcción de cada uno de los plásmidos fue verificada por mapeo de restricción y PCR. La secuenciación de los mismo fue realizada en un secuenciador automático ABI 373A siguiendo el método de Sanger. Conclusiones: A partir de estas cepas transformadas de Agrobacterium se infectaron en forma transiente plantas de tabaco para probar eficiencia en el proceso de transformación. Se visualizó la fluorescencia del gen reportero (GFP) confirmando la expresión heteróloga de cada uno de los genes trasnfectados.