Estudio metabolómico no dirigido para el análisis de la influencia de RSUME en los perfiles metabólicos de tumores von Hippel-Lindaudependientes

MARTINEFSKI, MANUELA R; KNOTT, MARÍA ELENA; JUAN MANUEL GUREVICH MESSINA; LUCAS TEDESCO; BELÉN ELGUERO; DAVID GOLNISKI; CORA POLLAK; EDUARDO ARZT; MARÍA EUGENIA MONGE

La Pampa

Congreso; 10 Congreso Argentino de Química Analítica; 2019

RSUME (RWD-containing sumoylation enhancer) es una proteína que participa en la cascada enzimática de sumoilación, ejerciendo una acción estimuladora sobre esta vía. Se ha demostrado que existe una alta expresión de RSUME en gliomas, tumores de hipófisis y von Hippel-Lindau (VHL)-dependientes, haciendo de RSUME un candidato clave para el entendimiento del desarrollo de dichas patologías1. La metabolómica es un campo emergente de la investigación ?ómica? especializado en el análisis global de metabolitos provenientes de organismos vivos a través de plataformas analíticas e informáticas2. Mediante el análisis del metaboloma es posible revelar el cambio en el estado metabólico de un sistema biológico como consecuencia de una patología. Este trabajo presenta resultados de un estudio metabolómico no dirigido diseñado para investigar la interacción de RSUME con VHL en un modelo in vitro. Para ello, se desarrolló un método de extracción de metabolitos intracelulares de líneas celulares humanas de carcinoma celular renal; se desarrolló un método analítico de cromatografía líquida de ultra alta performance en fase reversa acoplada a espectrometría de masas de alta resolución (RP-UHPLC-HRMS); y se analizaron los datos mediante métodos de análisis estadístico multivariado y univariado a fin de descubrir las vías metabólicas que son alteradas en presencia y/o ausencia de RSUME. Para la extracción del endometaboloma, se partió de la línea celular 786-O (VHL -/-; RSUME +/+), la cual fue transfectada con vectores de expresión de VHL y/o de silenciamiento de RSUME o sus vectores controles. Los extractos de metabolitos de un total de 120 muestras se liofilizaron y reconstituyeron para luego ser analizados por RP-UHPLC-HRMS. Los espectros de masa de alta resolución fueron adquiridos en modo de ionización negativo y positivo en el intervalo de m/z 50-1200 utilizando un espectrómetro de masas con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo (QTOF). Se extrajeron 12 matrices de variables metabólicas (pares tiempo de retención, relación masa/carga; Rt, m/z), para las combinaciones binarias estudiadas. A fin de encontrar paneles de variables discriminantes que permitieran diferenciar las clases de muestras comparadas, se optimizaron métodos de selección de variables (AlgGen, iPLSDA) acoplados al método supervisado de Análisis Discriminante por Proyección a Estructuras Latentes Ortogonalizado (OPLS-DA) con validación cruzada para analizar las matrices de datos previamente curadas de forma manual. Para la identificación de las variables discriminantes se utilizó el valor m/z exacto, el análisis del perfil isotópico, la búsqueda en bases de datos, experimentos de espectrometría de masas en tándem (RP-UHPLC-QTOF-MS/MS) y la posterior validación con estándares. Hasta el momento se han identificado 24 de 125 variables discriminantes.1Gerez J, Tedesco L, Bonfiglio JJ, Fuertes M, Barontini M, Silberstein S, Wu Y, Renner U, Páez-Pereda M, Holsboer F, Stalla GK, Arzt E, Oncogene, 34 (2015) 4855-4866. 2Monge ME, Dodds JN, Baker ES, Edison AS, Fernández FM, Annual Review of Analytical Chemistry, 12 (2019) https://doi.org/10.1146/annurev-anchem-061318-114959.