Diseño Experimental y Prácticas de Control de Calidad en Estudios de Metabolómica No Dirigida por Espectrometría de Masas

MANUELA MARTINEFSKI; GABRIEL RIQUELME; NICOLÁS ZABALEGUI; MAXIMILIAN A. REY; MALENA MANZI; MARÍA EUGENIA MONGE

Conferencia Virtual

Congreso; XI Congreso Argentino de Química Analítica; 2021

La metabolómica es el campo de la investigación ?ómica? especializado en el análisis global de metabolitos a través de plataformas analíticas e informáticas.1 Mediante el análisis del metaboloma es posible revelar el cambio en el estado metabólico de un sistema, por ejemplo, como consecuencia de una patología o de un dado tratamiento. En el área de salud, los estudios metabolómicos no dirigidos permiten obtener huellas digitales bioquímicas con poder de clasificación a partir del empleo de métodos quimiométricos y revelar potenciales biomarcadores con fines de diagnóstico, pronóstico y/o predictivos, así como también aumentar el conocimiento sobre los mecanismos bioquímicos involucrados en las patologías.El reconocimiento de la comunidad científica acerca de la necesidad de implementar buenas prácticas de aseguramiento (QA) y control de la calidad (QC) en estudios con abordajes no dirigidos se ha evidenciado a través de la creación en 2017 del consorcio internacional de QA y QC en metabolómica (mQACC).2 Entre los factores que influyen en la obtención de datos de calidad en este tipo de estudios utilizando la técnica de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS), se incluyen el diseño experimental de los protocolos de generación de muestras, el análisis de muestras de QC, el pre-procesamiento de datos y la identificación de las variables metabólicas (pares tiempo de retención, relación masa/carga) de interés con alto nivel de confianza.3-4 Entre las muestras de QC se incluyen muestras que permitan verificar la adecuación del sistema de LC-MS antes del análisis de lotes analíticos, blancos de solvente, blancos de preparación de muestras, muestras formadas por alícuotas de la totalidad o de una sub-población representativa del estudio (pooled QCs), diluciones seriadas de los mismos, estándares internos y materiales de referencia.3 Las etapas involucradas en el pre-procesamiento de datos de LC-MS permiten eliminar el ruido químico y la deriva instrumental a fin de obtener variables metabólicas analíticamente robustas. Cabe destacar que, a diferencia de los estudios dirigidos de cuantificación de analitos en muestras complejas, hasta el momento no hay consideraciones unificadas de acuerdo a normas vigentes que estén aceptadas por toda la comunidad para ejecutar estudios de metabolómica con abordajes no dirigidos. En este trabajo se presentarán diferentes estrategias empleadas para abordar un estudio metabolómico no dirigido diseñado para analizar muestras provenientes de modelos in vitro utilizando un método basado en cromatografía líquida de ultra alta performance en fase reversa acoplado a espectrometría de masas de alta resolución.5 Se ilustrará la importancia del diseño del protocolo de generación de muestras en relación al número y tipo de muestras y sus tratamientos, el efecto de la composición de la solución de lavado de líneas celulares y las consideraciones asociadas al empleo de más de un lote de medio de cultivo para la generación de muestras. A su vez, se detallarán las estrategias de curado de datos empleadas por el grupo de investigación, que incluyen criterios de inclusión y de exclusión de variables metabólicas y diferentes filtros, así como también estrategias para disminuir la redundancia de información causada por variables correlacionadas, con el fin de minimizar sesgo en el análisis de datos y contribuir a la identificación de variables analíticamente robustas. 1 Nicholson, J. K. & Lindon, J. C. Nature (2008) 455, 1054.2 Metabolomics Quality Assurance & Quality Control Consortium (mQACC). https://epi.grants.cancer.gov/Consortia/mQACC/ 3 Evans, A.E., O?Donovan, C., Playdon, M., Beecher, C., Beger, R. D., Bowden, J. A., Broadhurst, D., Clish, C. B., Dasari, S., Dunn, W. B., Griffin, J. L., Hartung, T., Hsu, P.-C., Huan, T., Jans, J., Jones, J. M., Kachman, M., Kleensang, A., Lewis, M. R., Monge, M. E., Mosley, J. D., Taylor, E., Tayyari, F., Theodoridis, G., Torta, F., Ubhi, B. K., Vuckovic, D., on behalf of the Metabolomics Quality Assurance, Quality Control Consortium (mQACC). Metabolomics (2020) 16:113.4 Monge, M. E., Dodds, J. N., Baker, E. S., Edison, A. S. & Fernández, F. M. Annual Review of Analytical Chemistry, (2019) 12, 177?99. 5 Martinefski, M. R., Elguero, B., Knott, M.E., Gonilski, D., Tedesco, L., Gurevich Messina, J.M., Pollak, C., Arzt, E. & Monge, M.E. Journal of Proteome Research (2021) 20 (1) 786-803.