Identificação de genes em Neurospora crassa modulados por NUC-2, uma proteína da família das anquirina

GRAS DE; REI EM; SILVEIRA HC; PERES NT; SANCHES PR; MAZUCATO M; MARTINEZ-ROSSI NM; ROSSI A

Salvador - Bahia

Congreso; 54º Congresso Brasileiro de Genética; 2008

Sociedade Brasileira de Genética

A regulação da expressão gênica é vital para todos os organismos e é especialmente requerida pelos fungos, para que eles se adaptem rapidamente às mudanças do meio ambiente. Estes mecanismos adaptativos são complexos e a maioria deles não está completamente esclarecida. O fosfato inorgânico (Pi), um nutriente essencial para todos os organismos, é requerido em importantes processos celulares como na biossíntese de ácidos nucléicos e sinalização metabólica. O sistema de aquisição do Pi em Neurospora crassa inclui pelo menos quatro genes regulatórios: nuc-2, preg, pgov e nuc-1. Em privação de Pi, NUC-2, uma proteína com domínio de repetição da anquirina, inibe o funcionamento do complexo PREG-PGOV, ativando assim o fator de transcrição NUC-1 e a expressão de fosfatases ácida e alcalina, fosfato permeases e nucleases. Visando entender a funcionalidade do gene nuc-2, como participante da via transdutora de sinal em resposta aos níveis de Pi, foram construídas duas bibliotecas subtrativas de cDNA (SSH) entre as linhagens St.L.74A selvagem e nuc-2A de N. crassa, cultivadas por 5 horas em Pi limitante. De um total de 900 clones subtraídos, 21% confirmaram expressão diferencial em experimentos de macro-arrays dot-blot. As seqüências destes clones foram processadas e analisadas pelo algoritmo BLASTx contra a base de dados de N. crassa do Broad Institute. Obtivemos 47 genes up-regulated e 17 genes down-regulated pela proteína NUC-2. Estes resultados foram validados por Virtual Northern blotting e Northern blotting, revelando o envolvimento de novos genes na resposta adaptativa dos microrganismos aos níveis de Pi. Entre os genes modulados negativamente pela proteína NUC-2, foi identificado um gene que codifica a proteína MAK-2 (mitogen-activated protein kinase-2), envolvida em vias de sinalização intracelular. Para estudar o papel deste gene no monitoramento do Pi extracelular, foi adquirida uma linhagem de N. crassa com o gene mak-2 inativado e foram realizados experimentos de microarrays de cDNA comparando as linhagens selvagem e mutante (mak-2ko), cultivadas em diferentes concentrações de Pi. Os resultados deste trabalho possibilitaram uma melhor compreensão das vias de sinalização intracelular e regulação gênica envolvidas na captação de Pi que permitem aos fungos sobreviverem em condições adversas.