Utilización de vectores adenovirales para evaluar el efecto del factor trófico pleiotrofina sobre un modelo de parkinsonismo experimental

I. TARAVINI; M CHERTOFF; E. CAFFERATA; J. FERRARIO; G. MURER; F. PITOSSI; O. GERSHANIK

ARGENTINA

Taller; VIII Taller Argentino de Neurociencias; 2006

<!-- /* Style Definitions */ p.MsoNormal, li.MsoNormal, div.MsoNormal {mso-style-parent:""; margin:0cm; margin-bottom:.0001pt; mso-pagination:widow-orphan; font-size:12.0pt; font-family:"Times New Roman"; mso-fareast-font-family:"Times New Roman"; mso-ansi-language:ES-AR; mso-fareast-language:ES-AR;} @page Section1 {size:612.0pt 792.0pt; margin:44.95pt 63.0pt 44.95pt 63.0pt; mso-header-margin:35.4pt; mso-footer-margin:35.4pt; mso-paper-source:0;} div.Section1 {page:Section1;} --> En la enfermedad de Parkinson se ven afectadas de manera selectiva las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra pars compacta (SNpc), las cuales inervan el estriado a través de la proyección nigroestriatal. Las neuronas remanentes sufren cambios plásticos espontáneos y favorecidos por el tratamiento con L-dopa. En nuestro laboratorio encontramos un aumento de la expresión del mRNA de pleiotrofina (PTN) en el estriado de ratas con lesión nigroestriatal tratadas crónicamente con L-dopa. Estudios recientes muestran que PTN promueve la sobrevida y diferenciación de neuronas dopaminérgicas en cultivos mesencefálicos fetales primarios e incrementa la diferenciación de células troncales embrionarias en neuronas dopaminérgicas. Asimismo, mediante doble inmunomarcación fluorescente, demostramos que ~61% de las neuronas PTN+ se localiza en interneuronas estriatales colinérgicas y ~42% en interneuronas GABAérgicas que expresan somatostatina/óxido nítrico sintetasa. Los objetivos de este trabajo son: I) desarrollar un vector adenoviral recombinante que exprese PTN, II) inducir la sobreexpresión de PTN en el estriado y la SNpc de ratas mediante el uso del vector viral, III) determinar si la sobreexpresión de PTN in vivo puede modificar la anatomía y función del sistema dopaminérgico adulto normal, y prevenir la degeneración o restaurar la anatomía y función del sistema dopaminérgico dañado. Se construyo el vector adenoviral que expresa PTN, clonando el cDNA de PTN humano en un plásmido con la region 5’ del adenovirus y co-transfectando con  la región 3’ del genoma del adenovirus tipo 5 (excepto las regiones E1 y E3) en células HEK293. Luego se amplificó el mismo en grandes preparaciones de células HEK293 y se purificó por centrifugación en un gradiente de CsCl. Verificamos la correcta recombinación mediante análisis con enzimas de restricción del DNA viral purificado por HIRT. Asimismo, se evaluó la contaminación por LPS y la presencia de partículas autoreplicativas mediante PCR, arrojando en ambos casos un resultado negativo. El título se determinó mediante aborbancia y dosis 50 infectiva en cultivo sobre células HEK293 para determinar el número de partículas infectivas respecto a la totales. Por último, logramos inducir la expresión de PTN tanto en el estriado como en la SNpc. Los avances obtenidos hasta el momento nos alientan a continuar con el estudio de los efectos de PTN sobre la prevención de la degeneración y la restauración del sistema nigroestriatal afectado en el parkinsonismo.