Determinación de la capacidad de implantación de embriones humanos mediante estudio metabolómico del medio de cultivo por espectroscopía infrarroja combinada con análisis multivariantes

CECILIA BEATRIZ FÍGOLI; OSVALDO YANTORNO; ALEJANDRA BOSCH

La Plata

Jornada; VI Jornadas de Ciencia y Tecnica; 2016

Facultad de Ciencias Exactas - Universidad Nacional de La Plata

La infertilidad es un trastorno multifactorial que se estima afecta al 15% de las parejas en edad reproductiva y constituye un problema de salud creciente debido a la postergación de la maternidad por motivos profesionales y sociales. En la Argentina, se realizan unos 9.000 ciclos de Reproducción Asistida al año, y se calcula que esa cifra se triplicará en los próximos años. De todos los tratamientos disponibles, las tecnologías de reproducción asistida (TRA) ofrecen los más altos índices de éxito a las parejas infértiles. A pesar de la amplia aplicación y de los avances en estas tecnologías en las últimas décadas, sólo aproximadamente el 25 % de los embriones formados implantan y dan como resultado un nacido vivo. Esto podría subsanarse en gran medida si se pudiera determinar con un alto grado de certeza, la viabilidad embrionaria en una cohorte de embriones a fin de seleccionar el/los embriones con mayor potencial de implantación. Actualmente los embriones son evaluados de manera no invasiva, mediante el análisis de su morfología por microscopía empleando una escala de clasificación de I a IV, o de forma invasiva, a través del Diagnóstico Genético Preimplantacional (DGP). En los últimos años las investigaciones en este campo se han dirigido al empleo de las denominadas técnicas ?OMICAS?, para establecer el potencial de los embriones para resultar en embarazo positivo. Estas disciplinas incluyen la genómica, la transcriptómica, la proteómica y/o la metabolómica. La metabolómica embrionaria se refiere al conjunto de disciplinas y técnicas dedicadas al estudio y análisis del conjunto de metabolitos no proteicos, intermediarios del metabolismo embrionario (aminoácidos, lactatos, azúcares, etc). Las técnicas más frecuentemente empleadas en el estudio de las OMICAS de los sistemas biológicos son las cromatográficas, espectroscópicas, espectrométricas de última generación, entre otras. La implementación de estas técnicas genera un conjunto de datos (curvas, gráficas, cromatogramas, espectros) cuyo análisis requiere de la aplicación de software avanzados basados en general en métodos estadísticos multivariantes, que permiten extraer la información buscada. El gran desafío contemporáneo consiste en desarrollar un método de selección de embriones con gran potencial de implantación, reduciendo el número de embriones a transferir sin comprometer el pronóstico de nacimientos exitosos.El objetivo de nuestro grupo de trabajo ha sido desarrollar una metodología que permita determinar el potencial de implantación de embriones obtenidos en procedimientos de fertilización asistida, a partir del análisis de espectros infrarrojos de sobrenadantes del cultivo de embriones combinado con el desarrollo de un software del tipo de redes neuronales artificiales o análisis de componente principal que permita discriminar y caracterizar los espectros IR obtenidos. Se ha buscado desarrollar una nueva estrategia no invasiva, que resulte más eficaz que los procedimientos actuales y que permita reducir la gestación múltiple. La investigación se está llevando a cabo a través de un trabajo interdisciplinario entre médicos de PREGNA Centro de Fertilización Asistida Buenos Aires, investigadores y una becaria Cofinanciada (PREGNA-CONICET), e investigadores del Centro de Efectividad Clínica IECS, Buenos Aires. A efectos de estas investigaciones se construyó una base de datos (Open-Clínica http://OpenClinica/pages/login) con la información clínica de pacientes, tratamientos, características de los embriones recolectados y resultados espectrales. También forman parte del grupo de trabajo el Prof. Dr Achim Kholer (Noruega), y el Dr. Juergen Schimitt de Alemania. Esquema general de trabajoLas Etapas 1 a 4 se realizan en PREGNA. Las pacientes bajo tratamiento de fertilización in vitro son hiperestimuladas siguiendo los protocolos regulares de hiperestimulación ovárica en PREGNA. Los embriones obtenidos son cultivados individualmente por 3 días. Previo a su transferencia son evaluados por su morfología y clasificados de acuerdo a su morfología. Los embriones que muestren mejor calidad (menos del 20% de fragmentación, sin vacuolas ni granularidad citoplasmática) son luego transferidos (1 o 2). Los sobrenadantes de los embriones transferidos son congelados para su posterior análisis por espectroscopía FTIR. PREGNA envía al CINDEFI los sobrenadantes de embriones y muestras de todos los lotes de los medios de cultivo empleados. Hasta el presente se almacenó la información correspondiente a 150 pacientes. Las Etapas 5, 6 y 7 se llevan a cabo en el CINDEFI. Hasta el momento se han incluido en la base de datos los espectros correspondientes a los embriones recuperados de 150 parejas en tratamientos de fertilización asistida (de 1 a 10 embriones de cada pareja y un cultivo control por cada una de ellas, aproximadamente 900 espectros), espectros de los diferentes lotes de medio de cultivo y de los lotes de aceite (depositado sobre los cultivos para evitar desecación a lo largo de los 3 días de incubación). Es importante aclarar que a todos los embriones (entre 1 y 10) de cada una de las cohortes de embriones se le analizó la morfología (MI a MIV), que es actualmente el criterio empleado a nivel mundial para seleccionar el/los embriones a transferir. Se transfirieron en PREGNA 1 o 2 embriones de cada pareja en tratamiento y el resto se congelaron. La Etapa 8 se lleva a cabo en CINDEFI. Se analizan los espectros aplicando los métodos de análisis de patterns o patrones más sencillos, tales como Análisis de Cluster (AC) o Análisis de Componente Principal (ACP) empleando las derivadas segundas normalizadas de los espectros. Los estudios realizados hasta el presente a través de un ACP muestran que los espectros pertenecientes a las muestras positivas fueron homogéneos, lo que refleja que habría alguna característica espectral que podría estar asociada a la metabolómica de embriones capaces de implantar. Por otro lado, los espectros de las muestras negativas se distribuyeron heterogéneamente demostrando que diversos factores metabólicos pueden estar influenciando la no implantación de embriones. Cuando la nube de datos espectrales fueron analizados por técnicas avanzadas de reconocimiento de patrones, tal como redes neuronales artificiales (NeuroDeveloper de software, SynthonGmbH, Heidelberg, Alemania) se pudo demostrar que estos otros factores externos no asociados a la metabolómica no permitían la obtención de modelos de implantación robustos. Se pudo establecer entonces, que existirían marcadores espectroscópicos asociados a la implantación, pero se podría incrementar la precisión, sensibilidad y especificidad de los modelos de discriminación si por un lado se ampliara la base de datos, y por el otro se incluyeran el modelo otros factores externos, no asociados a la metabolómica. Entre estos factores podríamos mencionar la morfología del embrión (MI, MII, MIII, MIV), la edad materna, el índice de masa corporal de la madre, el tabaquismo, el estado del útero, etc. Por lo que consideramos que el mejor enfoque sería aplicar un "análisis muti-bloque" teniendo en cuenta la metabolómica embrionaria medida por espectroscopía FTIR, además de las variables arriba mencionadas que participan en la implantación embrionaria.