EVALUACIÓN DE DISTINTAS METODOLOGIAS DE EXTRACCIÓN DE ADN PARA LA DETECCIÓN DE MYCOBACTERIUM BOVIS EN TEJIDOS.

BARANDIARAN; GARBACCIO; MARCELA MARTINEZ VIVOT; MARTIN JOSE ZUMARRAGA

Congreso; XIII Congreso Argentino de Microbiología ?; 2013

EVALUACIÓN DE DISTINTAS METODOLOGIAS DE EXTRACCIÓN DE ADN PARA LA DETECCIÓN DE MYCOBACTERIUM BOVIS EN TEJIDOS. Barandiaran S1, Garbaccio S. G2, Kiernicki M.C.1, Martinez Vivot M1, Zumarraga M.J3.   1 Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires, Argentina. 2 Instituto de Patobiología CICVyA, INTA, Buenos Aires, Argentina.  3 Instituto de Biotecnología CICVyA, INTA, Buenos Aires, Argentina.     La tuberculosis bovina (TBB) es una enfermedad de difusión mundial, causada por  Mycobacterium bovis. Este agente causal presenta implicancia en salud pública al tratarse de una zoonosis. Actualmente el diagnóstico se basa en la intradermorreacción (prueba tuberculínica-PPD); confirmándose en el laboratorio por cultivos, coloración específica y la tipificación del agente etiológico. Esta labor insume entre 4 y 8 semanas. El diagnóstico a través de pruebas moleculares como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), puede proveer un rápido y confiable resultado, disminuyendo significativamente el tiempo de confirmación. Un aspecto importante, previa realización PCR, es la eficacia de la metodología utilizada para extraer el ADN de la muestra clínica. El objetivo de este estudio fue evaluar tres metodologías de extracción de ADN seguido de PCR, a partir de un grupo de tejidos de animales naturalmente infectados. Dichos procedimientos fueron: extracción convencional de Fenol-Cloroformo-Isoamílico (F-Cl-I), Kit comercial Qiagen, ?DNeasy Blood & Tissues? (KQ) y comienzo de extracción fenólica seguido Kit Qiagen (FKQ). Luego de las extracciones se realizó la PCR utilizando como cebadores oligonucleótidos pertenecientes a la secuencia de inserción IS6110, específica del Mycobacterium tuberculosis complex. Fueron procesadas 15 muestras de tejidos con lesiones macroscópicas compatibles con TBB, 10 de ellas con aislamiento bacteriológico y  genotipificación de Mycobacterium bovis y las cinco (5) restantes, sin aislamiento bacteriológico confirmatorio. A su vez, fue agregado a este ensayo comparativo, una muestra de tejido sin lesiones y proveniente de un establecimiento libre de TBB, como control negativo. Se obtuvieron resultados positivos en cinco de los quince muestras procesadas (5+/15)  utilizando el KQ, siendo en un caso a partir de una muestra sin aislamiento. A través de la variante FKQ se obtuvieron (7+/15), dos de ellos también en muestras sin aislamiento. Por último, no se lograron resultados positivos mediante la extracción realizada con F:Cl:I. En todos los casos, se obtuvieron resultados negativos de la muestra control. Estos resultados preliminares indicarían que el método FKQ presenta una mayor capacidad de detección proponiendo su potencial aplicación (FKQ seguido de PCR), como ensayo complementario a la bacteriología convencional; fundamentalmente en aquellas muestras con lesiones compatibles con TBB y resultados bacteriológicos negativos. Estas metodologías deberán ser evaluadas utilizando un mayor número de muestras, permitiendo así concluir cual de ellas puede ser aplicada como una herramienta auxiliar útil, capaz de colaborar con el programa de control y erradicación de TBB.     Palabras claves: Mycobacterium bovis, PCR en tejidos.