METHODOLOGIES FOR THE PRESERVATION OF EMBRIONYC NEURAL STEM CELLS OF MURIN ORIGIN. STUDY OF THE DIFFUSION OF THE CRYOPROTECTANT AGENT DIMETHYL SULFOXIDE (DMSO)

MENDIA A; MARÍA C. ROBERT; MONTANER A; GUIBERT E.E.; BANCHIO C; RODRIGUEZ J.V.

Foz do Iguacu

Congreso; 9° Congreso Latino-Americano de Organos Artificiales y Biomateriales-COLAOB; 2016

Sociedad Latino Americana de Biomateriales, Órganos Artificiales e Ingeniería de Tejidos

Título:Desarrollo de protocolos para la preservación de Células Madre Neuronales Embrionarias (CMNE) de origen murino. I- Estudio de la difusión del agente crioprotector (ACP)Introducción: En nuestro laboratorio desarrollamos protocolos de preservación de células primarias como hepatocitos, cel. granulares de cerebelo y CMNE mediante la técnica de enfriamiento lento (slow cooling). Parte de estos protocolos comprende la carga de la células con el ACP para luego efectuar el enfriamiento programado. Las condiciones experimentales en las que se produzca el agregado del ACP a la suspensión celular involucra un compromiso entre la conc. del ACP, la temperatura y tiempo de incubación a los fines de no afectar la viabilidad y función del preparado post-preservación a -196 C.Objetivo: determinar las condiciones experimentales (temperatura y tiempo) que garantizen la difusión del ACP seleccionado -Dimetilsulfóxido (DMSO) - a las CMNE.Mat y Met: Las CMNE fueron obtenidas a partir de cerebros de embriones (13-15 días) de ratones C57/BL. Fueron cultivadas en neuroesferas de acuerdo a Ahlenius H et al. Chapter 18, Mouse Cell Culture, Met. Mol. Biol., 633 (2010). Luego fueron disgregadas y suspendidas en medio DMEM/F12/B27 + Suero fetal bovino 10 %, a una conc. de 1 106 cel/mL. Para la determinación cuantitativa de la concentración tanto intra como extracelular del DMSO se utilizó la técnica de HPLC descripta por Carpenter JF et al. Cryobiology 28:210-215 (1991) . El volumen celular se determinó de acuerdo a Rodriguez JV et al. Cryobiology 36, 236-244 (1998). En cada preparación se utilizaron a- 10 mL de susp. celular a los que se le agregó el DMSO 10 % y b) 10 mL de susp. celular a los que se le agregó el DMSO 10 % + 1 Ci de 3H2O (actividad específica: 1mCi/mL) + 0.5 Ci de 14C-Inulina (actividad específica: 2.6 mCi/g) + 0.05 mg/mL de inulina fría. Después de 2.5, 10 y 20 min de incubación a la temperatura seleccionada, de los tubos a- y b- se removieron 1 mL de la suspensión celular los que fueron centrifugados (12100 g ? 60 seg). El paquete celular y el sobrenadante fueron cuidadosamente separados. En las muestras provenientes de a- se determinó la conc. de DMSO en el pellet y en el medio de incubación, en las muestras b- el paquete celular fue disuelto en fluído de centelleo. Tanto en el sobrenadante como en el paquete celular se determinó la radioactividad utilizando un Contador de Centelleo Líquido con el fin de estimar los espacios acuosos de las CMNE. Se evaluaron las temperaturas de incubación, 10, 20 y 30 C, determinándose además la distribución de agua en CMNE incubadas a 37 C. Se determinó la evolución de la relación [DMSO]cel / [DMSO]medio , la evolución del H2Ointracel , la acumulación celular del DMSO en función del tiempo y temperatura de incubación, además para cada condición se determinó la viabilidad celular utilizando el test de exclusión de Trypan Blue (TB).Resultados: la relación [DMSO]cel / [DMSO]medio (Rel), obtenida durante la incubación a 20 y 30 C durante 10 minutos mostró la difusión y equilibramiento del ACP en las CNME: Rel 20C: 0.62  0.05, n=3 y Rel 30C: 0.72  0.101, n=3. Se obtuvo la mayor acumulación de DMSO para la incubación a 30 C: 436  22, n=3, g DMSO/106 cel. Estos datos concordaron con la disminución del agua intracelular respecto de los controles incubados a 37 C sin el ACP: H2Ointrace-37 C: 14.87  0.81 n=2; H2Ointrace-20 C: 6.59  0.90, n=3; H2Ointrace-30 C: 5.96  2.00, n=3, L H2O/106 cel. La disminución del agua intracelular es debido al desplazamiento de la misma por el ACP. La viabilidad celular determinada por el test de exclusión de TB para las células incubadas a 10, 20 y 30 C durante 10 minutos fueron mayores al 94 %. Conclusiones: La difusión del DMSO en las CMNE es dependiente de la temperatura de incubación. La difusión y acumulación del DMSO se incrementa con el aumento de la temperatura de incubación. No se observaron cambios importantes en la viabilidad celular con respecto al tiempo de exposición al DMSO en estas condiciones. Tanto a 20°C como a 30°C el DMSO ingresa a las células en concentraciones adecuadas, obteniéndose una relación [DMSO]cel / [DMSO]medio aproximada a 1, siendo necesario un tiempo de incubación no mayor a 10 minutos. La difusión del DMSO no aumenta de manera significativa al incrementar el tiempo de exposición. Las viabilidades obtenidas mostraron que no hubieron daños de membrana durante el procedimiento experimental, serán necesarios experimentos adicionales para demostrar la función de proliferación y diferenciación celular post-preservación .Proyecto: Validazione in vivo e sviluppo di nuove tecniche di criopreservazione di cellule epatiche e organo in toto financiado por: Regione Friuli Venezia Giulia (AAS n.2, DGR n.394 del 6.3.2015 Tabella 2, linea 14 ?Progetti internazionali e interventi umanitari?) y PICT 2013-0820 ANPCyT, Argentina.