DESARROLLO DE UN DISPOSITIVO DE ENFRIAMIENTO LENTO PARA MUESTRAS BIOLÓGICAS

JUAN DE PAZ L.; M. CELESTE ROBERT; GRAF D.; GUIBERT E.E.; RODRIGUEZ J.V.

Rosario

Jornada; VIII Jornadas de Ciencia y Tecnología- UNR; 2014

Universidad Nacional de Rosario

Durante el proceso de preservación de muestras biológicas a bajas temperaturas (criopreservación) se requiere, por lo general, mantener un estricto control sobre las condiciones de enfriamiento para lograr así establecer un protocolo que permita asegurar la viabilidad y funcionalidad de la muestra luego de la criopreservación. En consecuencia, numerosas compañías han desarrollado y comercializan sistemas de enfriamiento programado para suspensiones celulares y tejidos. El uso de estos sistemas supone un gasto excesivo para el procesamiento de un número reducido de muestras. En el presente trabajo, basados en la idea de Pye (1980), se desarrolló y caracterizó un dispositivo simple de enfriamiento controlado para la criopreservación de un número reducido de muestras biológicas de pequeño volumen (hasta 6 muestras de 2 mL). Para ilustrar una posible aplicación del dispositivo se presenta también un protocolo de criopreservación de células neuronales. En dicho protocolo, el dispositivo planteado se emplea para: a) incubar la muestra con un agente crioprotector a 10ºC y permitir la difusión del mismo al medio intracelular, b) enfriar la muestra de manera controlada a diferentes velocidades hasta una temperatura final de -50ºC y c) registrar la curva de enfriamiento y determinar la temperatura de nucleación (Tc) con el objetivo de monitorear todo el proceso. El dispositivo de enfriamiento controlado consiste en: 1- Un termo tipo Dewar de 2 L conteniendo el refrigerante (nitrógeno líquido), 2- Una cámara de enfriamiento que contiene el medio de intercambio de calor (metanol) y un soporte para las muestras, 3- Un agitador magnético de velocidad fija, 4- Una barra de cobre cilíndrica en contacto con el medio de intercambio y el refrigerante, 5- Un termómetro electrónico TES-1384 (TES Electrical, Taiwan) conectado a una PC. El flujo de calor entre el termo Dewar y la cámara de enfriamiento se produce a través de la barra de cobre. Seleccionando el diámetro de la misma (1/4?; 3/8?; 1/2? y 5/8?) puede controlarse la velocidad de enfriamiento del medio y de las muestras sumergidas en él. Durante el proceso de enfriamiento se registran tanto la temperatura del baño como la de una muestra testigo, mediante el uso de dos termocuplas tipo K conectadas a un termómetro electrónico. Estos datos se vuelcan en un grafico de temperatura vs tiempo el cual se utiliza para calcular la velocidad de enfriamiento mediante la regresión lineal de la región previa al pico de nucleación espontánea. Se obtuvieron seis velocidades de enfriamiento (0,4 ± 0,02 °C/min; 1,2 ± 0,2 °C/min; 1,9 ± 0,1 °C/min; 3,1 ± 0,5 °C/min; 4,1 ± 0,3 °C/min y 7,0 ± 1,9 °C/min) mediante el uso de distintas combinaciones de barras de cobre. Para cada determinación se empleó un volumen aproximado de 2L de N2L. Se estudió la influencia de la velocidad de agitación del medio sobre la velocidad de enfriamiento obtenida. Las velocidades evaluadas no mostraron efectos apreciables sobre la velocidad de enfriamiento por lo que se seleccionó una velocidad intermedia (780 RPM). Tampoco se observaron variaciones de la velocidad de enfriamiento al modificar el número de muestras enfriadas. El diseño propuesto es simple y permitió la optimización de una metodología de enfriamiento lento para la criopreservación de células neuronales de rata. Las condiciones optimas de viabilidad y funcionalidad posterior al paso de recalentamiento fueron obtenidas con células enfriadas a 3.1 ± 0.5 °C/min hasta una temperatura cercana a los -50 °C para luego sumergirlas en N2L para su almacenamiento.