Desarrollo de Metodologías para la criopreservación de Células Neuronales de Rata

M. CELESTE ROBERT; BERARDI F.; JUAN DE PAZ L.; RODRIGUEZ J.V.

Rosario

Jornada; VI Jornada de Ciencia y Tecnología; 2012

Secretaría de Ciencia y Tecnología, UNR

DESARROLLO DE METODOLOGÍAS PARA LA CRIOPRESERVACIÓN DE CÉLULAS NEURONALES DE RATA. Robert M.C., Berardi F., Juan de Paz L., Rodriguez J.V. Centro Binacional (Argentina-Italia) de Criobiología Clínica y Aplicada- CAIC- Universidad Nacional de Rosario. E-Mail: celeste_robert@hotmail.com Introducción: Las células neuronales aisladas del cerebro tienen un gran número de aplicaciones en la investigación y la clínica. Sin embargo, uno de los principales problemas para su utilización es su correcta preservación. La criopreservación ha permitido el almacenamiento de rutina de otros tipos celulares por largos periodos de tiempos, pero no ha sido aplicada con suficiente éxito en las células neuronales. La criopreservación mediante enfriamiento lento (slow cooling) es una de las metodologías comúnmente aplicadas, en la cual la velocidad de enfriamiento alcanzada permite una lenta deshidratación celular y formación de hielo extracelular, evitando de esta manera la formación de hielo intracelular y sus efectos nocivos. Objetivo: Optimizar la metodología de slow cooling para preservar neuronas granulares aisladas de cerebelo de rata; evaluando sus efectos sobre la viabilidad y funcionalidad de las células después del descongelamiento (rewarming). Materiales y Métodos: Las células granulares de cerebelo fueron aisladas de ratas Wistar de 8 días de vida como descripto previamente por Verdaguer y col. (Verdaguer, et al 2002. Br. J. Pharmacol. 35, 1297?1307). Una parte de las células aisladas se cultivaron en placas recubiertas con poli-L-lisina en medio BME suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino, 2 mM de L-glutamina, 0,1 mg/ml de gentamicina y 25 mM de KCl (Medio Completo), a 37°C en 95% aire humidificado y 5% de CO2. El resto de la suspensión celular fue criopreservada a diferentes velocidades de enfriamiento. Brevemente, 20x106 células recién aisladas fueron resuspendidas en 1 ml de Medio Completo con 10% de Me2SO (agente crioprotector), preenfriadas a 10°C por 10 min, y criopreservadas por la metodología de slow cooling a las siguientes velocidades de enfriamiento: 0.40°C/min, 1.46°C/min y 3.44°C/min. Estas velocidades se obtuvieron utilizando un dispositivo de intercambio térmico ajustable, con el cual se procedió a criopreservar las muestras y evaluar los distintos parámetros del proceso. Las muestras fueron conservadas en N2 líquido por aproximadamente 7 días, momento en el que se procedió a realizar el rewarming y puesta en cultivo. La viabilidad celular (células viables/ células totales x 100) antes e inmediatamente después de la criopreservación y rewarming fue evaluada mediante el test de exclusión de azul tripan (0,4% w/v). La función mitocondrial de las células control y criopreservadas a 7 días de cultivo fue evaluada a través de la reducción de MTT. El rendimiento de células viables al finalizar el proceso de criopreservación-rewarming (número de células viables post-criopreservación-rewarming/ número de células viables antes de la criopreservación x 100) fue calculado para evaluar la fracción de células viables que sobreviven al proceso de criopreservación. Resultados Preliminares: La viabilidad celular obtenida post-rewarming disminuyo significativamente con la velocidad de enfriamiento, de 76.6% ± 9.59 a 3.44°C/min, a 68.0% a 1.46°C/min y a 64.9% ± 0.37 a 0.4°C/min. De la misma manera el rendimiento de células viables disminuyo drásticamente de 29.8% ± 4.9, a 8.64% y a 3.9% ± 4.1, respectivamente para 3.44°C/min, 1.46°C/min y 0.4°C/min, indicando una importante pérdida de células durante todo el proceso de preservación. Solo las células granulares criopreservadas a 3.44°C/min fueron capaces de adherirse a las placas de cultivo, desarrollar sus axones y permanecer en cultivo por al menos 7 días; siendo su función mitocondrial similar a la de los cultivos control a 7 días.