CLONADO Y EXPRESIÓN EN BACTERIAS DE UN FRAGMENTO DEL GEN DE LA HEMAGLUTININA PROVENIENTE DE UNA CEPA LOCAL DE VIRUS DISTEMPER CANINO

GALLO CALDERÓN, M; ROMANUTTI, C.; KELLER L; BOADO L; LA TORRE, J

Jornada; XIII Congreso Argentino de Virologia; 2021

El virus Distemper Canino (VDC) (género Morbillivirus; familia Paramyxoviridae) afecta a caninos silvestres y domésticos y causa síntomas respiratorios, gastrointestinales y nerviosos. Actualmente, se encuentran disponibles vacunas vivas atenuadas conteniendocepas virales obtenidas en los años 40s. El genoma de VDC es un ARN monocatenario de sentido negativo, y su envoltura contiene las glicoproteínas: hemaglutinina (H) y de fusión (F) que están involucradas en la unión a la membrana celular en la primera etapa de la infección. En nuestro laboratorio se ha realizado el diagnostico molecular de VDC desde el año 2003 y se ha logrado el clonado y secuenciación de genes completos (F, H, NP) provenientes de cepas locales. Con el fin de obtener una fuente de antígeno que pueda ser utilizado en ELISA para monitorear la infección por VDC en perros, se realizó el clonado de una versión truncada del gen h, comprendida entre los nucleótidos 774 y 1824, de una cepa local de VDC, en un vector de expresión procariota. Utilizando como material de partida el vector pGEMT-HBruno y primers con sitios KpnI/HindIII, se obtuvo por PCR un fragmento de 1051 pares de bases, que luego de ser clonado en pGEMT y secuenciado para verificar la ausencia de mutaciones y codones stop prematuros, fue subclonado en el vector pRSETB. Se transformaron bacterias E. Coli BL21 y se estudiaron distintas condiciones de inducción: concentraciones de IPTG, tiempos, medios y temperaturas. La expresión de la proteína recombinante (46.736 Kda) fue óptima con 0.5 mM de IPTG, en LB, a 37°C y mayoritariamente se obtuvo en cuerpos de inclusión. Fue visualizada en geles de poliacrilamida teñidos con Coomassie Blue y por Western Blot, con un suero específico anti H y con un anticuerpo comercial anti histidina. La purificación se realizó en batch con Níquel, obteniéndose un rendimiento de 0.5 ug/ul de proteína recombinante. En este trabajo, obtuvimos una posible herramienta para el diagnóstico de VDC.