Predicción Estructura-Función: El uso de herramientas bioinformáticas para identificar aspectos funcionales de isozimas de Aspartil Proteasas

REVUELTA MV; ORTS, F; ARJEN TEN HAVE

Mar del Plata

Encuentro; V Biólogos en Red; 2010

Se ha incrementado de forma exponencial la cantidad de secuencias proteícas y o desecuencias ADN codificantes en los últimos años dado el avance en las tecnologías desecuenciación. Asimismo, se han desarrollado numerosas técnicas para el análisis desecuencias proteicas con el propósito de identificar aspectos funcionales de enzimas antes dellevar estos estudios al laboratorio. Secuencias genómicas han demostrado que varias enzimasestán codificadas por grandes familias de genes. En el presente trabajo, mostramos a través de un case study   de "Predicción Estructura-Función" cómo se realiza una búsqueda de aspectosfuncionales en un grupo de isozimas de Aspartil Proteasas.La base para el estudio de Predicción Estructura-Función es un Alineamiento Múltiple deSecuencias (MSA), que permite comparar las isozimas hasta el nivel de residuo. Un problemaprincipal es la generación del MSA, que es una tarea mucho más difícil de que lo parece segúnpor ej. Clustal, el software más usado para hacer MSA. Existen otros paquetes (entre ellos, T-Coffee, Muscle y Probcons) que generan mejores MSA pero existen familias de proteínas quemuestran niveles de variación tan altos, que los alineamientos automáticos están condenadosal fracaso. La corrección manual en por ej. Genedoc debe incluir el control estructural deproteínas cristalizadas obtenidas del Protein Data Bank (PDB) y generalmente resulta en unMSA biológicamente relevante.A partir de un MSA robusto pueden realizarse estudios de filogenia. Una filogenia muestra cómo las secuencias están relacionadas entre sí. La dificultad en la interpretación de filogeniasque existe se deriva de aspectos taxonómicos y de varios aspectos funcionales, por ej.mantener el pKa de un residuo del sitio catalítico, la estabilidad en un rango de temperatura, laestructura 3D y la accesibilidad del sustrato al sitio catalítico. En el presente trabajo presentamos un estudio de Predicción Estructura-Función de las aspartilpeptidasas tipo A01 (APs). Las APs se encuentran en hongos, plantas, animales y hasta encierto grupo de bacterias. Actúan a pH ácido y poseen 2 lóbulos homólogos producto de unproceso ancestral de duplicación. Cada lóbulo aporta un residuo Asp requerido para la catálisis.Partiendo de un juego de 14 APs provenientes del hongo planta-patógeno Botrytis cinerea (Bc),mediante búsqueda del tipo BLASTP en las bases de datos de NCBI, BROAD y JGI generamosun alineamiento de aproximadamente 580 secuencias, y luego realizamos un análisisfilogenético (PHYML). Nuestros resultados indican que existen al menos 6 clados de APsdiferenciables en vez de las dos clases de AP A01 descriptos por MEROPS, la autoridad ennomenclatura de peptidasas. La filogenia muestra claramente aspectos taxonómicos perotambién muestra bifurcaciones que no corresponden a la taxonomía, las que derivan dealgunos aspectos funcionales. Usando algoritmos y paquetes de Bioinformática (por ej. ETviewer, Mutual Information, Diverge) estudiamos cuáles son los residuos responsables de estasbifurcaciones. Estudios estructurales usando modelado 3D y Autodocking pueden indicar cuáles el probable aspecto funcional del cambio responsable de la bifurcación. Nuestros resultadosindican que entre el clado formado por las BcAPs 3, 4, 6, 11 y 12 y aquel formado por BcAP13hay diferencias funcionales, aún teniendo ambos mayoritariamente proteasas con anclaje GPI. COMULATOR (indicador de residuos con mutación correlacionada) presenta tambiéndiferencias para cada clado, sugiriendo un functional constraint   diferencial. Un estudio de conservación de residuos por grupo (LOGOS) indicó también discrepancias, lo cual podríarepercutir en variantes en el pKa o temperatura óptimos de actividad para cada enzima.Actualmente, estamos realizando estudios que nos permitirán continuar con la identificación delos residuos de importancia en el mantenimiento de la función y estructura de estas enzimas.