Nanoscopía de fluorescencia tridimensional con resolución por debajo de 10 nm basada en la utilización de excitación súper-crítica

SZALAI, ALAN M.; SIARRY, BRUNO; LUKIN, JERÓNIMO; WILLIAMSON, DAVID; UNSAIN, NICOLÁS; REFOJO, DAMIÁN; CÁCERES, ALFREDO; PILO-PAIS, MAURICIO; OWEN, DYLAN; ACUNA, GUILLERMO; SIMONCELLI, SABRINA; STEFANI, FERNANDO D.

Congreso; XIX Encuentro de superficies y materiales nanoestructurados; 2019

La microscopía de fluorescencia es una de las técnicas más utilizadas en los estudios de sistemas biológicos. Sin embargo, su resolución está limitada por la difracción de la luz a un valor de ~ 250 nm. El conjunto de técnicas de súper-resolución, también llamadas nanoscopías, logró superar esta limitación gracias al control de las transiciones entre estados emisivos y no emisivos de las sondas fluorescentes, llegando recientemente a registrarse observaciones con una resolución de ~ 1nm [1]. La necesidad de observar estructuras biológicas extendidas en tres dimensiones con resolución nanométrica llevó rápidamente al desarrollo de nanoscopías que cumpliesen este requisito. Sin embargo, la mayoría de ellas presentan una resolución inferior en el eje axial al que se obtiene en dos dimensiones, limitándose generalmente a 40-50 nm. En el presente trabajo, se propone una técnica que permite resolver estructuras con una resolución por debajo de 10 nm en las tres dimensiones. La misma consiste en combinar nanoscopías basadas en la localización de moléculas individuales, como dSTORM [2] o DNA-PAINT [3], y la utilización de iluminación súper-crítica (microscopía TIRF). Al emplear este tipo de iluminación, la intensidad de la onda evanescente que penetra en la muestra decae en forma exponencial luego de atravesar la interfase vidrio/muestra. De este modo, las moléculas que se encuentran más cercanas al vidrio son excitadas con mayor intensidad que las que se encuentran más alejadas, y el número de fotones posteriormente emitidos provee información acerca de la posición axial de los fluoróforos. En este trabajo realizamos una calibración fotométrica adecuada con origamis de ADN [4] para caracterizar la iluminación del microscopio utilizado y posteriormente observamos estructuras biológicas como los anillos de espectrina o la región hueca interior de los microtúbulos, obteniendo una resolución menor a 10 nm.