Aislamiento, identificación y transfección de células mesenquimales de médula ósea de oveja para su utilización en regeneración miocárdica experimental

OLEA FD; LOCATELLI P; PÉREZ SÁEZ JM; SEPÚLVEDA D; HNATIUK A; BUSSMANN U; BERCOVICH A; LAGUENS R; CROTTOGINI A.

Mar del Plata, Buenos Aires

Congreso; LV Reunión Anual de la SAIC, Reunión de la SAFIS y XLII Reunión de la SAFE; 2010

Sociedad Argentina de Fisiología

Las células mesenquimales (MSCs) de médula ósea (MO) han demostrado tener efectos regenerativos en el infarto agudo de miocardio (IAM) experimental, probablemente a través de un efecto parácrino liberando factores de crecimiento. Por otra parte, hemos demostrado que en ovejas con IAM la transfección con un plásmido codificante para VEGF165 humano (pVEGF165) disminuye el tamaño del IAM y mejora la función ventricular. Por lo tanto, se esperaría que las MSCs modificadas para sobreexpresar VEGF tengan mayor efecto beneficioso que las MSCs no modificadas. Como primer paso para demostrarlo, nuestro objetivo fue aislar e identificar MSCs de MO ovinas, transfectarlas con el pVEGF165 y rastrear su presencia en el miocardio inyectado con las mismas. Métodos: En 10 ovejas adultas se extrajo MO por punción de cresta ilíaca. Se aislaron las células monucleares por gradiente de Ficoll-Hypaque 1077 g/mL, y se cultivaron en DMEM más SFB las adherentes hasta confluencia y pasaje 4. Estas células se identificaron por citometría de flujo con anticuerpos contra CD44, CD166 y CD45, y por su diferenciación a adipocitos. Luego se las transfectó con un plásmido codificante para GFP y se comparó la eficiencia de transfección utilizando distintos reactivos (Lipofectamine 2000, Superfectine y GeneJuice) a diferentes concentraciones. Una vez optimizada la técnica de transfección, las MSCs se transfectaron con pVEGF165, se marcaron con CM DiI, y se inyectaron en el miocardio ovino peri-infarto para rastrearlas a 6 días de inyectadas. Resultados: Se confirmó que las células eran MSCs por su perfil inmunológico (CD44+, CD166+, CD45-) y su diferenciación a adipocitos. Las MSCs transfectadas se detectaron en el miocardio peri-infarto por inmunofluorescencia y tinción con DAPI. Conclusión: Es posible aislar, identificar y transfectar MSCs ovinas, y detectar su viabilidad hasta por lo menos 6 días post-inyección, haciendo factible su utilización en protocolos de regeneración miocárdica experimental.