Evaluación de la expresión de factores pro y antiinflamatorios en muestras hepáticas de vacas lecheras durante el periodo de transición

ORTIZ DE ZÁRATE, J; MORA, S.; BENZ, M; ANGELI, E.; REY, F; SALVETTI N.; HEIN G.; MATILLER V.

Esperanza

Jornada; XI Jornada de Difusión de la Investigación y Extensión de la Facultad de Ciencias Veterinarias; 2023

FCV-UNL

Evaluación de la expresión de factores pro y antiinflamatorios en muestras hepáticas de vacas lecheras durante el periodo de transición.Ortíz de Zárate J2, Mora S1, Benz M2, Angeli E1, Rey F1, Salvetti NR 1, Hein GJ1, Matiller V1.1 Laboratorio de Biología Celular y Molecular Aplicada Instituto de Ciencias Veterinarias del Litoral (ICiVet-Litoral), Universidad Nacional del Litoral (UNL) / Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Esperanza, Santa Fe, Argentina / 2 Facultad de Ciencias Veterinarias del Litoral, UNL, Esperanza, Santa Fe, Argentina.juandiego498@gmail.comEn los sistemas de producción de leche bovina actuales, las vacas sufren adaptaciones metabólicas importantes, principalmente durante el período de transición (PT). Este periodo transcurre desde tres semanas antes del parto hasta tres semanas posteriores al mismo. Las crecientes demandas de nutrientes y energía de los animales no pueden ser satisfechas a través de la ingesta de alimentos y conduce a una lipomovilización desde los tejidos corporales; en consecuencia, la excesiva liberación de ácidos grasos suele superar la capacidad metabólica del hígado, pudiendo conducir a enfermedades hepáticas como hígado graso o cetosis. El PT ha sido descripto como un período proinflamatorio caracterizado por enfermedades infecciosas frecuentes. Las interleuquinas, como el factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) y la interleuquina 6 (IL-6), han sido señaladas como elementos importantes en el desarrollo de inflamación a. La Interleuquina 4 (IL-4) regula la producción de anticuerpos y el desarrollo de respuestas de células T efectoras. Además, en vacas con hígado graso, la lesión hepática promueve la generación de mediadores profibrogénicos como el Factor de Crecimiento Transformante -β 1(TGF-B1) y el TNF-α b. Es por ello, que el objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de TNF-α e IL-6 como factores proinflamatorios y de TGF-B1 e IL-4 como factores antiinflamatorios, mediante inmunohistoquímica indirecta (IHQ) en biopsias hepáticas obtenidas de vacas durante el PT.Se seleccionaron cinco vacas Holando Argentino, de una granja lechera comercial de la localidad de Hipatia (31°07'S, 61°03'W), Santa Fe, Argentina; de segunda a cuarta lactancia, con un producción a 305 días de 8934 ± 423 litros (media ± DE) . Los animales fueron examinados clínicamente antes y durante el ensayo, y no mostraron evidencia de trastornos tales como retención de placenta, fiebre de leche clínica y subclínica, mastitis, metritis, cetosis clínica y subclínica, desplazamiento de abomaso, problemas podales y/o trastornos gastrointestinales clínicos. En este estudio solo se incluyeron animales sanos. Se tomaron muestras de sangre de vena yugular y de biopsias hepáticas a los 21 (±3) días antes de la fecha prevista de parto, y 7 (±3) y 21 (±3) días posteriores al parto. Las biopsias de aproximadamente 500 mg de tejido hepático fueron obtenidas por punción según lo descripto por Angeli y col.c. Las muestras fueron fijadas en formaldehído tamponado al 4% y procesadas de acuerdo a las técnicas histológicas de rutina hasta su inclusión en parafina. Se efectuaron cortes seriados de 4 μm de espesor con un micrótomo Leica R450, y se montaron en portaobjetos previamente tratados con 3-aminopropyl-triethoxysilane (Sigma, USA). Sobre estos cortes se realizó la técnica de IHQ indirecta para la determinación in situ de los factores evaluados mediante el empleo de anticuerpos específicos, para TNF-α: Mouse monoclonal 77830, MAB686, Rabbit Polyclonal AHP852Z para IL-6, Rabbit polyclonal IgG SC-146 para TGF-β y Polyclonal Goat IgG RyD AF2469 para IL-4. Los cortes se desparafinaron, rehidrataron y se realizó recuperación antigénica, bloqueando la actividad de peroxidasa endógena. Luego de la incubación con el anticuerpo primario, se utilizó un kit comercial de un anticuerpo secundario biotinilado, seguido de estreptavidina-peroxidasa (Cell Marque). Finalmente, la reacción fue revelada utilizando 3,3' diaminobencidina (Dako) como cromógeno y se realizó la contracoloración con hematoxilina (Biopur). Las imágenes fueron obtenidas mediante un microscopio Óptico Nikon Eclipse y digitalizadas mediante una cámara Nikon conectada a una computadora de escritorio. La evaluación de la técnica de IHQ se realizó por análisis digital de imágenes, utilizando el sistema Image-Pro Plus 3.0.1 (Media Cybernetic) siguiendo métodos ya descritptos d. Se evaluó el porcentaje de área marcada y los datos obtenidos fueron evaluados mediante el programa estadístico SPSS 25.0.0 para Windows. Se realizó un análisis de la varianza de los datos obtenidos de la inmunomarcación en los distintos tiempos de muestreo aplicando pruebas paramétricas para varios grupos (ANOVA), y como análisis posterior se aplicó el post-test de Duncan.Los resultados mostraron expresión de los factores evaluados en el citoplasma de los hepatocitos de todas las muestras analizadas. Se determinó un aumento significativo en la expresión de IL-6 y de IL-4 los días 7 y 21 posparto en relación con el día -21 (preparto), sin registrar cambios significativos en TNF-α y en TGF-B1. Porcentaje de área inmunomarcada para TNF-α, IL-6, IL-4 y TGF-B1 en muestras de biopsias hepáticas en los diferentes tiempos.Letras diferentes indican diferencias significativas (p < 0,05).Estos resultados se vinculan con resultados obtenidos previamente por nuestro grupo de trabajoC, donde se muestra una relación con la condición corporal de los animales y el estado de desbalance metabólico. Éstas y otras determinaciones que se están realizando actualmente en nuestro laboratorio, contribuirán al mayor conocimiento de los factores que contribuyen en la función hepática de la vaca en transición de animales de la región.Bibliografíaa- Trevisi E., Amadori M., Cogrossi S., Razzuoli E., Bertoni G. 2012. Metabolic stress and inflammatory response in high-yielding, periparturient dairy cows. Res. Vet. Sci., 93: 695–704.b-Zhang C, Shao Q, Liu M, Wang X, Loor JJ, Jiang Q, Cuan S, Li X, Wang J, Li Y, He L, Huang Y, Liu G, Lei L. Liver fibrosis is a common pathological change in the liver of dairy cows with fatty liver. J Dairy Sci. 2023 Apr;106(4):2700-2715.c- Angeli E., Trionfini V., Gareis N.C., Matiller V., Huber E., Rey F., Salvetti N.R., Ortega H.H., Hein G.J. 2019. Protein and gene expression of relevant enzymes and nuclear receptor of hepatic lipid metabolism in grazing dairy cattle during the transition period. Res. Vet. Sci., 123: 223–231.d- Díaz P.U., Hein G.J., Belotti E.M., Rodriguez F.M., Rey F., Amweg N.A., Matiller V., Baravalle M.E.; Ortega H.H., Salvetti N.R. BMP2, 4, 6 and BMPR1B are altered from early stages of bovine cystic ovarian disease development. Reproduction, 152(4): 333-50.