Patogénesis de Leptospira interrogans ex vivo: ¿Es realmente esta bacteria un patógeno extracelular?

ARIEL NAGEL; MARÍA JOSÉ GRAVISACO; CECILIA VÁSQUEZ; VANINA VARNI; KARINA CAIMI

Rosario

Congreso; Congreso Latinoamericano y Argentino de Microbiología 2016; 2016

Asociación Argentina de Microbiología y Asociación Latinoamericana de Microbiología

Introducción: Leptospira no es considerada un patógeno intracelular clásico. Aún asi, estudios recientes sugieren que diferentes fases intracelulares podrían jugar un rol importante en la patogénesis debido a que las leptospiras deben atravesar diversas capas celulares para su diseminación. Distintos trabajos in vitro las señalan como ?transientemente intracelulares? dado que se las observó atravesando monocapas celulares y a su vez persistiendo en macrófagos. Nuestro grupo de trabajo tiene como principal objetivo identificar factores de virulencia involucrados en la patogénesis bacteriana, teniendo como fin último la generación de candidatos vacunales específicos contra las serovariedades circulantes en Argentina. Para ello utilizamos aislamientos locales que pertenecen a genotipos y variedades circulantes de manera mayoritaria en nuestro país. En tal sentido, el objetivo de este trabajo fue establecer si una cepa de Leptospira interrogans sv Pomona (AKRFB) perteneciente a dichas variantes, es capaz de localizarse intracelularmente como posible método de diseminación. Materiales y métodos: La evaluación de la localización intracelular de AKRFB se realizó mediante citometría de flujo y microscopía confocal. En ambos casos se utilizaron cultivos primarios de células mononucleares derivadas de sangre periférica (PBMCs) de bovinos sanos que se infectaron con leptospiras marcadas con CFSE (verde) a una MOI de 50. En ambos ensayos se trató las células con citocalasina D para evaluar el efecto de la fagocitosis en la vía de ingreso de la bacteria. Para el ensayo de citometría de flujo las células se trataron con Trypan blue 0.4% a fin de eliminar la fluorescencia extracelular y se fijaron con PFA 4% para su posterior corrida en el citómetro. Para el ensayo de microscopía confocal, y a fin de evaluar en que compartimento celular se localizan las bacterias, las células se tiñeron con Lysotracker (marcador de lisosomas, rojo) y también se fijaron las células con PFA 4%. Posteriormente, se realizó una inmunofluorescencia indirecta con Lamp3 (azul) para marcar lisosomas tardíos y se observó la colocalización al microscopio confocal. Resultados: En el ensayo de citometría, se observó un valor 3 veces menor en el número de bacterias intracelulares comparado con el obtenido en las células sin tratar. Los resultados de microscopía confocal indican la colocalización de lisosomas tardíos y leptospiras. Conclusiones: Los resultados obtenidos indicarían una posible entrada de L. interrogans al macrófago no sólo mediada por fagocitosis, si bien esta vía también estaría involucrada en el proceso de infección. Asimismo, la microscopía confocal permitió determinar que las leptospiras se ubicarían en compartimentos de tipo lisosomal tardíos. Si bien estos resultados son preliminares, permiten postular que probablemente las leptospiras puedan realizar una etapa intracelular situándose en compartimentos de tipo lisosomal tardíos en el caso de PBMCs bovinos.