Esquema de MLST reducido para tipificación molecular de Leptospira sp. directamente sobre muestras clínicas

VANINA VARNI; YOSENA CHIANI; PAULA RUYBAL; BIBIANA VANASCO; KARINA CAIMI

La Plata

Congreso; III Congreso Panamericano de Zoonosis - VIII Congreso Argentino de Zoonosis; 2014

Sociedad Argentina de Zoonosis

Introducción. La leptospirosis es una enfermedad causada por distintas especies del género Leptospira y constituye una zoonosis distribuida mundialmente. La clasificación tradicional de las cepas de Leptospira sp. se basa en métodos serológicos que presentan una alta complejidad en su aplicación y obtención de resultados. En la actualidad existen métodos moleculares alternativos para la tipificación de aislamientos. Entre ellos, la metodología de multilocus sequence typing (MLST) permite genotipificar las especies patógenas de Leptospira, siendo una de sus principales ventajas la comparación global de aislamientos a través de su perfil alélico. Recientemente nuestro grupo realizó una reevaluación de dichos métodos mediante la cual se obtuvo un esquema de MLST optimizado de 7 loci. Debido a que la obtención de aislamientos es sumamente difícil, en particular para muestras provenientes de humanos, el objetivo de este trabajo fue la adaptación del esquema de tipificación para su aplicación directa sobre muestras clínicas, con la perspectiva de ampliar el número de muestras tipificadas y posibilitar un mejor seguimiento epidemiológico de esta zoonosis. Materiales y Métodos. Se trabajó con muestras de sueros y ADN extraído de sueros provenientes de pacientes que presentaron serología positiva a leptospirosis; éstas se caracterizaron a nivel de especie mediante amplificación por PCR-16S rARN. A partir del esquema de 7 loci se seleccionaron los 3 loci más discriminativos (MLST reducido) para su amplificación directa sobre las muestras clínicas que resultaron positivas a la PCR 16S. La capacidad de tipificación del esquema reducido se estudió a partir de secuencias obtenidas en la generación del esquema completo. Se concatenaron los 3 loci elegidos y se incluyeron en un análisis filogenético (Maximum Likelihood, MEGA5). Resultados. El análisis filogenético realizado con secuencias previas confirmó que el esquema reducido de 3 loci concuerda con el esquema completo en la agrupación de los aislamientos de la misma especie; asimismo permite reconocer subagrupamientos de los aislamientos dentro de cada cluster específico, validando su potencial para la tipificación. A partir de estos resultados se implementó el esquema reducido en un total de 57 muestras clínicas de las cuales 35 pudieron ser amplificadas por 16S rARN. Se obtuvo que el 91 % pertenecían a las principales especies patógenas: L. interrogans, L. borgpetersenii y L. kirschneri. A partir de estas muestras se logró amplificación positiva para los 3 marcadores (MSLT reducido) en sólo 2 de ellas, ambas provenientes de ADN extraído de suero. Adicionalmente, 8 muestras pudieron ser amplificadas con sólo 1 ó 2 de los 3 loci. Las muestras positivas a los 3 loci pertenecen a la especie L. interrogans y el árbol filogenético construido permitió observar que ambas correlacionan con aislamientos pertenecientes a los serogrupos Canicola e Icterohaemorragiae. Discusión. La resultados obtenidos en este estudio constituyen un antecedente de suma importancia para la epidemiología molecular de Leptospira sp., ya que el desarrollo de una herramienta de tipificación directa sobre muestras clínicas permitirá incrementar significativamente la información sobre los genotipos circulantes de esta bacteria, con utilidad tanto en el diagnóstico como en el control epidemiológico de esta enfermedad.