Aplicación de un plásmido recombinante como herramienta para la detección de mutaciones truncantes en los genes MSH2 y BRCA1

MARZESE DM; REAL SM; GOMEZ LC; MAYORGA LS; ROQUÉ M

Congreso; 50 Reunión Científica Anual. SAIC; 2005

La detección precoz de los codones de terminación ( PSC ) en los genes humanos es muy útil para el diagnóstico genético de los diferentes tipos de cáncer hereditarios, por ejemplo, Familiar Cáncer de Mama y hereditario no asociado a poliposis cáncer colorrectal ( HNPCC ) . Los productos de estos PSCs son proteínas truncadas, detectables in vitro mediante el ensayo de truncamiento de proteínas e in vivo mediante el uso de la maquinaria de traducción de estar de levadura o bacterias. Estas estrategias se basan en que viven la construcción de plásmidos recombinantes donde se inserta la secuencia humana de interés aguas arriba de un gen informador . Aunque simple, estos ensayos tienen sus limitaciones. El sistema de levadura requiere una amplia labor para mejorar su especificidad , y los sistemas bacterianos dió muchos resultados falsos debido a la traducción eventos re- iniciación ocurren correos PSC . Nuestro objetivo era diseñar un plásmido recombinante útil para la detección de PSCs en genes humanos y resistente a las bacterias interferencias traducción re- iniciación. RESULTADOS : Un plásmido recombinante funcional ( PREAL ) fue diseñado basado en un sistema de dos híbridos bacteriana. En nuestro diseño , la traducción in vivo de los fragmentos fusionados de la Bordetella pertussis adenilato ciclasa activa la producción de cAMP dando lugar a un fenotipo seleccionable bacteriano . Cuando se inserta un gen de interés entre los dos fragmentos , cualquier PSC inhibe la actividad enzimática del producto , y los acontecimientos traducción re- iniciación rendimiento post- PSC separa fragmentos inactivos . Hemos demostrado que el sistema puede detectar con precisión PSCs en genes humanos mediante la inserción de fragmentos mutados del gen BRCA1 y MSH2 . Ensayos de Western blot revelaron eventos traducción re- iniciación en todas las colonias probadas , lo que implica que un plásmido simple no sería resistente a esta fuente de resultados falsos negativos. La aplicación del sistema a una familia HNPCC con una mutación sin sentido en el gen MSH2 diagnosticado correctamente homocigotos de tipo salvaje y los pacientes heterocigotos . CONCLUSIÓN : La preal desarrollado es aplicable a la detección de PSCs en genes humanos relacionados con diferentes enfermedades y es resistente a los eventos traducción re- iniciación. Los pasos son fáciles de diagnóstico , tienen un bajo costo , detectar sólo las mutaciones patológicas , y permitir el análisis de alelos separados.