DESARROLLO BIOTECNOLOGICO DE UN SISTEMA CUALI/CUANTITATIVO PARA LA DETECCION DE TELOMERASA EN CANCER DE COLON.

GOMEZ L; ADI J; ROQUÉ M

Jornada; XXII Jornadas de Investigación y IV Jornadas de Posgrado de la Universidad Nacional de Cuyo; 2010

Una de las características tumorales estudiadas como posible marcador precoz del cáncer de colon es el ARNm de la subunidad proteica de telomerasa (hTERT). Esta enzima presenta 2 sitios de splicing más frecuentes (alfa y beta. Basándonos en estos datos, nuestro objetivo fue desarrollar un sistema cuali/cuantitativo para la detección sensible y específica de las 4 variantes más frecuentes de splicing de la ribonucleoproteina telomerasa (a+b+, a-b+, a+b- y a-b-). El desarrollo biotecnológico se basó en la estrategia ?Reverse-Transcripted Multiplex Ligation dependent Probe Amplification? (RT-MLPA). Se comenzo con una retrotranscripción del ARN total obtenido de la línea celular HeLa y de tumores colonicos mediante tres primers distintos para telomerasa (hTERT total, variantes b+ y b-) y uno para b2-microglobulina (beta2-M) como control ?housekeeping?. Luego, el ADNc fue incubado con distintos pares de sondas (β2M, hTERT total, y la variante a+), posteriormente ligadas, y amplificadas con el mismo set de primers marcados. Los productos fueron resueltos por electroforesis convencional en geles de poliacrilamida y luego por electroforesis capilar en un secuenciador ABi3130 y analizados con el programa GenMarker v1.75. Una vez verificado su buen funcionamiento, se realizó una retrotranscripción en conjunto (multiplex) para b2M y hTERT total y el ADNc obtenido fue hibridado con una mix de pares de sondas (b2M, hTERT total). En segunda instancia se realizo un primer ensayo aislado para a+b+y otro para a+b- y luego se realizaron a ensayos con mezclas de primers y sondas para β2M y las variantes a+b+y a+b-. Los resultados obtenidos nos permiten confirmar que el diseño es eficiente y especifico para detectar β2M, hTERT total y las 2 combinaciones de las variantes de splicing (a+b+, a+b-) en tumores de colonicos y células HeLa.