Optimización y validación biológica de un ensayo in Vitro con la cepa Dm23-c de Trypanosoma cruzi transfectada con β-galactosidasa

GULIN, JEN; ROCCO, DM; ALONSO, V; CRIBB, P; ALTCHEH, J; GARCÍA BOURNISSEN, F

CABA

Congreso; III° Congreso Latinoamericano de Métodos Alternativos al Uso de Animales de Experimentación en Educación, Investigación e Industria (COLAMA 2018); 2018

AACyTAL - FESSACAL

Las opciones terapéuticas para la enfermedad de Chagas se limitan a benznidazol (BZ) y nifurtmox (NFX). En este contexto, se requieren medicamentos más seguros y eficaces. Utilizando la cepa Dm28c de T. cruzi transfectada con el gen pLacZ de E. coli se desarrolló y validó un ensayo in vitro, considerando que el uso de dicha cepa genéticamente modificada para el cribado de alto rendimiento no altera la sensibilidad a las drogas convencionales de la cepa salvaje.Se sembraron 10.000 células Vero C-76 por pocillo en placas de 96 pocillos. Luego de 24 hs, se infectaron con tripomastigotes (cepa Dm28c/pLacZ) a distinta relación parásito:célula (MOI = 1:1; 5:1 ó 10:1), con diferentes tiempos de incubación (2, 6 ó 24 hs) y se agregó BZ (10 μM) o medio de cultivo (NT). A los 3, 4 ó 5 días postinfección (dpi), se añadió clorofenol rojo-β-Dgalactopiranósido 100 μM y Nonidet-P40 al 0,1% (concentraciones finales). Las placas fueron leídas en lector de ELISA a 570 nm, luego de incubación a 2, 4, 6 y 24 hs. De 27 combinaciones, se establecieron las condiciones óptimas: MOI = 5:1, 2 hs de interacción y revelado al 4to dpi con 4 hs de incubación, con diferencias estadísticamente significativas entre pocillos BZ y NT (p=0,0023; valor D=0,75). En simultáneo, se determinó la sensibilidad a BZ y NFX, comparando el método convencional y colorimétrico. La concentración de fármacoque produjo la lisis del 50% de tripomastigotes (LC50) fue 41,36 y 24,52 μM para BZ y NFX, mientras que en el método colorimétrico, la LC50 fue 44,74 y 38,94 μM, respectivamente.Se estableció un ensayo colorimétrico con la cepa Dm28c/pLacZ de T. cruzi con valores biológicamente significativos de sensibilidad a BZ y NFX in vitro. Este sistema será aplicado al cribado de grandes bibliotecas de fármacos para identificar compuestos activos contra T. cruzi.