Micrométodo cromatográfico de elevada sensibilidad para la determianción simultánea de retinol y alfa tocoferol en plasma. Su aplicación en colestsis intrahepática del embarazo

MARTINEFSKI M; SCIOSCIA S.; SAMASSA, P; CONTIN M; LUCANGIOLI S.; TRIPODI V.

Congreso; Congreso de Química Analítica y Técnicas Afines; 2013

Introducción: En los últimos años la investigación de vitaminas liposolubles en muestras biológicas ha cobrado gran importancia para la salud dado que su deficiencia contribuye en la patogénesis de numerosas enfermedades principalmente relacionadas al estrés oxidativo. Es por ello que el conocimiento de los niveles de estas vitaminas en muestras biológicas es muy importante desde el punto de vista médico, epidemiológico y nutricional, puesto que no sólo permite estimar el estado de salud, sino también implementar una terapéutica de suplementación en casos en donde sea evidente su deficiencia. Dentro del grupo de vitaminas liposolubles, el retinol y el α-tocoferol resultan los principales componentes del sistema antioxidante protegiendo a las membranas celulares contra la peroxidación. La determinación simultánea de ambas vitaminas en matrices biológicas resulta un desafío analítico, debido a su inestabilidad, diferentes polaridades y la necesidad de una compleja preparación de la muestra. Los sistemas analíticos actualmente utilizados presentan ciertos inconvenientes tales como elevado consumo de solventes orgánicos, preparaciones de muestras en múltiples etapas, la utilización de aditivos para evitar el deterioro de las vitaminas, la necesidad del uso de un patrón interno de cuantificación para compensar pérdidas de analito que ocurre durante las etapas de extracción, alto requerimiento de muestras y sensibilidad comprometida en estados de deficiencia vitamínica. Todo lo expuesto impacta en la recuperación de los analitos, el costo, la contaminación ambiental y en la calidad analítica global de la determinación. Una de las tendencias actuales de la química analítica avanzada es la miniaturización de los procedimientos sin afectar la sencillez del sistema. Separaciones ultrarrápidas, el consumo de pequeñas cantidades de muestras y reactivos, así como elevada sensibilidad y posibilidad de automatización, son algunos de los objetivos analíticos más importantes fundamentalmente ante la necesidad de un diagnóstico preciso. Una de las patologías posiblemente afectada por la deficiencia de las vitaminas liposolubles es la colestasis intrahepática del embarazo (CIE). La CIE se caracteriza por la acumulación de ácidos biliares hidrofóbicos, los cuales inducen estrés oxidativo y apoptosis debido a su acción detergente y la generación de radicales libres, disminuyendo la capacidad antioxidante. Es, por tanto, considerada una condición de alto riesgo dado que puede provocar serias consecuencias para el feto tales como incremento de partos prematuros, distress fetal y mortalidad perinatal. Objetivos: Desarrollar y validar un método por microHPLC-UV para la determinación simultánea de retinol y α-tocoferol en plasma que mejore las condiciones de los métodos convencionales. Evaluar los niveles plasmáticos de retinol y α-tocoferol en pacientes con CIE Pacientes: Las pacientes fueron derivadas del Hospital de Clínicas "José de San Martín". Se incluyeron 19 pacientes embarazadas con CIE, diagnosticados según criterios clínicos y bioquímicos, y 37 pacientes con embarazos normales. Se obtuvo el consentimiento informado en cada caso. Materiales y Métodos: La separación cromatográfica de vitaminas se llevó a cabo con una microcolumna Hypersil BDS C18 (Thermo Scientific) (100 mm x2,1mm ID, 2,4 μm), una guarda columna C18, flujo 0,4 mL/min, temperatura de la columna: 25ºC, detección UV visible dual 296 y 325nm, inyección: 10μL, fase móvil: Metanol:Agua (94:6). El equipo utilizado fue un HPLC Thermo Scientific con bomba cuaternaria e inyección automática. Resultados: La validación del método mostró una excelente linealidad (r2: 0,998 y 0,997), alta sensibilidad (LOD: 0,02 y 0,11μM, LOQ: 0,07 y 0,36μM), elevada recuperación (96,0-104,0% y 99,3-102,0%) para retinol y α-tocoferol, respectivamente. La preparación de muestra consiste en una precipitación proteica de 50μL de plasma con 1-propanol,seguido de evaporación bajo atmosfera de nitrógeno y reconstitución en metanol con posterior inyección al sistema cromatográfico. El método desarrollado requiere de 20 minutos desde la preparación de muestra hasta el informe del resultado. Los niveles plasmáticos de α-tocoferol en los embarazos complicados con CIE resultaron significativamente inferiores respecto de los controles (13.1±2.9 vs 22.4±2.2μM, media±SEM, p<0.05). Al evaluar los niveles plasmáticos de retinol en los grupos en estudio no se observaron diferencias significativas (1.27±0.21 vs 1.25±0.10μM, media±SEM, CIE vs controles). Conclusiones: El método desarrollado es simple, preciso, rápido y altamente sensible utilizando microHPLC con detección UV para la cuantificación simultánea de retinol y α-tocoferol en plasma. Las ventajas del método propuesto son: menores tiempos de análisis, se requiere escaso volumen de muestra, menos consumo de solventes orgánico, no requiere de la utilización de estándar interno, menor LOD y LOQ respecto a los métodos tradicionales. En cuanto a la aplicación del sistema desarrollado se comprobó una disminución significativa de los niveles plasmáticos de α-tocoferol en pacientes con CIE, mientras que los niveles de retinol son comparables con los controles. El reconocimiento de la deficiencia de α-tocoferol en CIE es importante dado que puede ser el punto de partida para considerar la suplementación preventiva de la misma a fin de proteger tanto a la madre como al neonato contra la producción de radicales libres disminuyendo así el riesgo durante el parto. Por otro lado, debido al bajo requerimiento de muestra se puede aplicar dicho método para la determinación de los niveles plasmáticos de dichas vitaminas liposolubles en la población pediátrica en investigaciones futuras.