Cuantificación simultánea de 8 esteroides séricos de relevancia en endocrinología pediátrica por LC-APCI-MS/MS

MARTINEFSKI, MANUELA R.; AMBAO, VERÓNICA; RODRIGUEZ, MARÍA EUGENIA; BALLERINI, MARÍA GABRIELA; REY, RODOLFO; MONGE, MARÍA EUGENIA; ROPELATO, MARÍA GABRIELA

Jornada; APORTES AL DESARROLLO DE NUEVAS HERRAMIENTAS TERAPÉUTICAS Y DE DIAGNÓSTICOFFyB y FCEN 2022; 2022

La determinación precisa y específica de las hormonas esteroides es una herramienta fundamental para el correcto diagnóstico y seguimiento de patología endocrinológica, más aún en pacientes pediátricos. La mayoría de los métodos utilizados en la clínica se basan en inmunoensayos, cuya exactitud es cuestionable debido a limitaciones de especificidad por efectos de matriz que puede dar lugar a la sobrestimación de los niveles de esteroides y menor sensibilidad sobre todo para muestras pediátricas. La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) es una metodología analítica para la determinación específica, precisa y simultánea de diferentes hormonas esteroides, requiriendo un mínimo volumen de muestra, un método simple de preparación a menor costo comparado con las metodologías por inmunoensayo.El objetivo del presente trabajo fue desarrollar y validar un método por LC-MS/MS utilizando una fuente de ionización química a presión atmosférica (APCI) operada en modo de ionización positivo para determinar simultáneamente un panel de 8 esteroides: cortisol, androstenediona, testosterona, progesterona, pregnenolona, 17-hidroxiprogesterona (17OHProgesterona), 17-hidroxipregnenolona (17OHPregnenolona) y dehidroepiandrosterona (DHEA) en muestras de suero de infantes menores de 1 año de edad con y sin patología endocrinológica.La metodología propuesta incluyó una precipitación de proteínas en la etapa de preparación de muestras. A su vez, se desarrolló un método de cromatografía en fase reversa acoplado a un método de espectrometría de masas en modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Se utilizaron dos transiciones ion precursor-ion producto (una cuantificadora y una cualificadora) para cada esteroide y su respectivo estándar interno marcado isotópicamente. Los parámetros que se optimizaron fueron el volumen de muestra, el gradiente cromatográfico, la temperatura y voltaje de la fuente de ionización, el caudal de gas en la fuente de APCI, y el voltaje en la celda de colisiones para cada transición. El método fue validado de acuerdo con las guías provistas por la FDA y la EMA. La validación se realizó en términos de exactitud y precisión intra- e inter-día a 4 niveles (LLOQ, bajo, medio y alto), LOD y LOQ, rango lineal, efecto matriz, integridad de la dilución, estabilidad y selectividad. A su vez, se analizaron controles de calidad externos (RIQAS) y un material de referencia (NIST SRM 1950). La exactitud del método se evaluó en términos de recuperación, obteniéndose recuperaciones absolutas de 91-111% y 96-110% para los ensayos intra- e inter-día, respectivamente. Los porcentajes RSD como medida de precisión intra- e inter-día no superaron 7,4% y 12,0%, respectivamente. La cuantificación se llevó a cabo utilizando curvas de calibración en suero libre de esteroides con estándar interno. Los valores de LOD y LOQ se establecieron en los intervalos: 0,007-1,0 ng mL-1, y 0,02-3 ng mL-1, respectivamente. La prueba de aplicabilidad se realizó con éxito analizando 80 muestras pediátricas: 61 controles [40 niños y 21 niñas, mediana (rango) de edad: 17 (3-349 días)] y 19 pacientes con sospecha y/o patología endocrinológica confirmada [38 (7-348 días)].La metodología desarrollada y validada resultó ser simple, rápida, sensible, selectiva, reproducible y aplicable a la determinación de hormonas esteroides en muestras de suero. El método desarrollado por LC-APCI-MS/MS se aplicó exitosamente para el análisis de esteroides en muestras pediátricas y constituye una herramienta eficaz para diagnóstico y seguimiento de trastornos de la esteroideogénesis en etapas tempranas de la vida.