Desarrollo de una estrategia de metabolómica no dirigida para evaluar el impacto de NEDD8 sobre el perfil metabólico neuronal

MARTINEFSKI, MANUELA R.; MANZI, M; LINENBERG, IVANA; GIUSTI, SEBASTIAN; REFOJO, DAMIÁN; MONGE, MARÍA EUGENIA

Congreso; IV Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2022

El grupo de investigación de Neurobiología Molecular del IBioBA-Max Planck ha identificado aNEDD8 como una modificación post-traduccional que impacta sobre centenas de proteínasintracelulares y además es esencial en neuronas para el desarrollo, mantenimiento y función dedendritas y sinapsis.1-3 Resultados previos del grupo de investigación sugieren que la neddilaciónpodría cumplir un rol muy relevante en el metabolismo celular.2En el presente trabajo, se desarrollóun método analítico mediante un abordaje de metabolómica no dirigida utilizando cromatografíalíquida de ultra alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas de alta resolución medianteuna fuente de ionización por electrospray (UPLC-ESI-HRMS), para estudiar el impacto de laactividad neuronal y la inhibición de la neddilación sobre el perfil metabólico neuronal. Para ello, sedesarrolló un método de extracción de metabolitos intracelulares a partir de muestras de cultivosprimarios de neuronas corticales e hipocampales de modelos murinos. La metodología propuestapara la preparación de muestras involucró una etapa de quenching del metabolismo celularutilizando nitrógeno líquido y posterior extracción del endometaboloma con una mezcla deagua:metanol:acetonitrilo (10:50:40 v/v/v). Asimismo, se seleccionaron los compuestos marcadosisotópicamente para ser utilizados como estándares internos que permitan identificar fuentes devariabilidad asociadas a la preparación de las muestras y a la variabilidad instrumental en elabordaje no dirigido y así poder identificar potenciales outliers y evaluar la calidad de los datos. Para separar y detectar los metabolitos, se desarrolló un método de cromatografía hidrofílica (HILIC). Las fases móviles consistieron en una solución 5 mM de acetato de amonio pH 3,5 con 5% de acetonitrilo (A) y acetonitrilo (B), utilizando un gradiente de 16 minutos. La temperatura de la columna fue de 35 ºC y las muestras se mantuvieron a 5 ºC durante el análisis. Se utilizó un espectrómetro de masas con analizador de cuadrupolo tiempo de vuelo, el cual fue operado en ambos modos de ionización y los datos fueron procesados por Progenesis QI y TidyMS(https://github.com/griquelme/tidyms). El método se optimizó para evitar carry-over, y fueexitosamente evaluado en un estudio piloto que involucró el análisis de muestras de neuronas encultivo que fueron sometidas a los siguientes tratamientos: i) DMSO (control), ii) MLN4924 (inhibidor de neddilación), iii) tratamiento con 4AP/Bic (activación neuronal) en DMSO; iv) MLN4924 + 4AP/Bic Los resultados preliminares sugieren que existen variables metabólicas discriminantes que permiten diferenciar los tratamientos evaluados.