Estructuras de ARN del 3’ no codificante del virus del dengue son esenciales para la amplificación del genoma viral

DIEGO E. ALVAREZ; JUAN A. MONDOTTE; ANDREA V. GAMARNIK

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue es un miembro de la familia Flaviviridae. Los flavivirus tienen un genoma de ARN simple cadena de polaridad positiva de aproximadamente 11kb. El genoma viral consta de un único marco de lectura abierto que codifica para una poliproteína que es procesada para dar lugar a las proteínas estructurales y a las proteínas no estructurales involucradas en la replicación del virus. El marco de lectura se encuentra flanqueado por las regiones 5’- y 3’-no codificantes (NC). La región 5’-NC tiene 98 nucleótidos (nts) y una estructura cap en su extremo 5’. La región 3’-NC tiene 458 nts y carece de una cola de poli(A). Esta región forma estructuras secundarias altamente conservadas con dominios definidos. Además en el 3’NC se encuentran regiones conservadas entre flavivirus complementarias a secuencias del extremo 5’ del genoma. Utilizando microscopía de fuerza atómica para visualizar moléculas individuales, encontramos que los extremos del ARN viral pueden estar en contacto por medio de la interacción ARN-ARN de larga distancia, y que esta interacción resulta en la circularización del genoma. Además, demostramos que dichas interacciones de larga distancia entre las secuencias complementarias son esenciales para la replicación del virus. Se ha propuesto para distintos virus de ARN que la circularizacion del genoma puede cumplir un papel en el control de traducción, amplificación o encapsidacion del ARN viral. Sin embargo, para el caso del virus del dengue y de otros flavivirus se desconocen los mecanismos moleculares por medio de los cuales la circularización del ARN regula la utilización del genoma en cada una de las etapas del ciclo de replicación. Con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas para analizar a nivel molecular cada paso de la replicación del virus del dengue, diseñamos construcciones de ARN genómicas y subgenómicas que permiten la expresión de genes reporteros como la luciferasa y la proteina verde fluorescente. En el contexto de un clon infeccioso del virus del dengue tipo 2, se reemplazó la secuencia codificante de las proteínas estructurales por el gen de la luciferasa para construir un replicón subgenómico (DVRep). El ARN de DVRep obtenido por transcripción in vitro y transfectado en células en cultivo permite analizar los procesos de síntesis de proteínas virales y amplificación del genoma mediante la medida de actividad luciferasa en función del tiempo. El pico de actividad luciferasa que se observa entre las 8 y 10 hs post transfección refleja la traducción del ARN transfectado, mientras que luego de las 60 hs los niveles de luciferasa representan la amplificación del ARN por la polimerasa viral. Utilizando este sistema se realizaron mutaciones y deleciones de las regiones de ARN conservadas en el 3’NC. Para estudiar la función de la circularización del genoma en la replicación, diseñamos mutantes en las que las secuencias complementarias se modificaron separadamente, para impedir la circularización, o bien simultaneamente, para reconstituir la complementariedad. Los resultados obtenidos sugieren que la circularización del genoma no participaría en la regulación de la iniciación de traducción. Por el contrario, la complementariedad de secuencias entre los extremos es esencial para la amplificación del genoma. Del análisis de los niveles de traducción y amplificación del ARN de mutantes en los que se delecionaron cada uno de los dominios estructurales del 3’NC concluimos que la región 3’NC no participaría del control de iniciación de traducción, en tanto que sus dominios individuales contribuyen a una eficiente amplificación del ARN. Además, encontramos que una región del 3´NC ubicada después del codón de terminación de traducción regula diferencialmente la replicación en células de mosquito y de mamífero.