Función de la interacción entre los extremos 5’ y 3’ del genoma del virus de dengue durante la replicación

DIEGO E. ALVAREZ; ANDREA V. GAMARNIK

Encuentro; XXVI Reunión Científica Anual de SAV; 2006

Sociedad Argentina de Virología

El virus del dengue es un miembro de la familia Flaviviridae. Los flavivirus tienen un genoma de ARN simple cadena de polaridad positiva de aproximadamente 11kb. El genoma viral consta de un único marco de lectura abierto flanqueado por las regiones 5’- y 3’-no codificantes (NC). Se ha propuesto para virus de ARN que estructuras y secuencias del genoma viral participan en el control de traducción, amplificación y/o encapsidación del genoma. En el caso de flavivirus se ha propuesto que los extemos 5’ y 3’ del genoma interaccionan directamente a través de secuencias complementarias. En trabajos previos del laboratorio mapeamos dos pares de secuencias complementarias necesarias para la interacción ARN-ARN de larga distancia. El primer par de secuencias está altamente conservado entre flavivirus y se conoce como 5’-3’ CS, el segundo par de secuencias lo denominamos 5’-3’ UAR (upstream AUG region) por su ubicación en el 5’NC antes del codón de iniciación de traducción. Utilizando microscopía de fuerza atómica pudimos determinar que estas secuencias median la circularización del genoma del virus del dengue. Para estudiar la función de la interacción a distancia mediada por las secuencias identificadas se desarrollaron herramientas genéticas que nos permitien analizar la replicación viral en células infectadas o transfectadas con ARNs virales. Con el objetivo de determinar el papel que juega la interacción 5’-3’ en cada uno de los pasos del ciclo de  replicación desarrollamos en el laboratorio un ARN subgenómico del virus de dengue que expresa el gen de la luciferasa como reportero. Esta construcción permite discriminar mediante la medición de actividad de luciferasa los procesos de traducción y síntesis de ARN. Valiéndonos de esta herramienta generamos una batería de mutantes en las secuencias complementarias de los extremos 5’ y 3’ del genoma de dengue para estudiar su función durante la replicación del virus. Estos estudios nos permitieron determinar que la interacción ARN-ARN participa en el proceso de amplificación del genoma sin afectar la eficiencia de traducción del ARN viral. Además, con el objetivo de evaluar el requerimiento de secuencia en el contexto del apareamiento de bases entre los extremos 5’ y 3’ de un clon infeccioso del virus de dengue, generamos ARNs genómicos  con mutaciones que interfieren en la interacción ARN-ARN de larga distancia. El análisis de secuencia de los virus recuperados indica que su evolución en cultivo da lugar a reversiones o covariación de secuencias que restablecen contactos entre las regiones complementarias del ARN del virus. Los resultados presentados en este trabajo nos permiten concluir que las interacciones ARN-ARN a distancia entre los extremos del genoma de dengue son esenciales para la iniciación de la síntesis del ARN del virus.