La replicación del virus de dengue requiere de estructuras de RNA alternativas que involucran al extremo 3’ del genoma viral

DIEGO E. ALVAREZ; ANDREA V. GAMARNIK

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virologia

El virus de dengue (DENV) es un miembro de la familia Flaviviridae. Los flavivirus tienen un genoma de ARN simple cadena de polaridad positiva de aproximadamente 11kb. El genoma viral consta de un único marco de lectura abierto flanqueado por las regiones 5’- y 3’-no codificantes (NC). Distintas estructuras secundarias y terciarias de RNA presentes en los genomas virales participan en el control de traducción, amplificación y/o encapsidación durante el ciclo de replicación del virus. Trabajos previos de nuestro laboratorio han demostrado que mediante la interacción RNA-RNA a distancia entre los extremos del genoma viral el RNA de DENV puede adquirir una conformación circular que permite el inicio de la síntesis de RNA de cadena negativa en el extremo 3’ del genoma. En esta interacción participan dos pares de secuencias complementarias invertidas, la primera se denomina CS, y la segunda UAR (upstream AUG region), por su ubicación en el extremo 5’NC antes del codón de inicio de la traducción. En el extremo 3’ del genoma, la secuencia UAR forma parte de una estructura muy conservada entre los flavivirus conocida como 3’ stem-loop (3’SL). La interacción entre 5’ y 3’ UAR provoca cambios importantes en el plegamiento de las estructuras de RNA de los extremos 5’ y 3’. El objetivo de este trabajo es realizar un análisis funcional de la interacción 5’-3’ UAR y estudiar las estructuras de RNA involucradas en esta interacción. Para esto utilizamos un sistema de genética reversa que nos permite introducir cambios en el contexto del genoma de DENV y analizar su impacto en la replicación luego de la transfección de RNA mutantes en células en cultivo. Utilizando esta herramienta generamos una serie de mutantes en las secuencias 5’ y 3’ UAR de manera tal de impedir el contacto entre estas regiones o reconstituirlo con secuencias artificiales. Observamos que cuando la interacción entre las secuencias 5’ y 3’ UAR está impedida, los virus evolucionan en cultivo para dar lugar a reversiones o seudo-reversiones que restablecen contactos entre estas secuencias. Curiosamente, uno de los genomas mutantes en el cual la interacción 5’-3’ UAR se mantiene por secuencias complementarias introducidas artificialmente da lugar a un virus que lleva una seudo-reversión. El nucleótido que cambia en esta secuencia no está involucrado en la interacción RNA-RNA a distancia sino que forma parte de una estructura de horquilla que se encuentra río arriba del 3’SL. Esta horquilla sólo se forma cuando el genoma esta en conformación lineal. Por lo tanto la recuperación in vivo de esta estructura sugiere que la forma lineal del genoma viral es esencial para la replicación. Para evaluar esta hipótesis generamos RNA genómicos con mutaciones en el contexto de esta estructura. Cuando realizamos transfecciones de estos RNA en células en cultivo encontramos que las mutaciones que impiden la formación de la horquilla también impiden la replicación viral, confirmando un papel fundamental de este elemento durante la replicación. Conclusiones Debido a que la formación de esta horquilla excluye la interacción 5’-3’UAR, concluimos que la estructura del genoma del virus del dengue es dinámica, adquiriendo una conformación circular o lineal, siendo ambas indispensables para su replicación.