Caracterización de una línea de Macrófagos Bovinos (BoMAc) para su uso en estudios de fisiopatología de la reproducción en bovinos.

ETCHEVERS L; CATTANEO MOREYRA ML; RENNA, MS; AMWEG, A.N.; ORTEGA, H.H.; REY, F.; SALVETTI, N.R.; STASSI A.F.

Jornada; IX JORNADA DE DIFUSIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y EXTENSIÓN; 2021

El sistema inmune contribuye a la regulación de la función ovárica y participa en diferentes eventosdentro del folículo ovárico, incluyendo la maduración del ovocito, la ovulación, la fertilización, y otros.Las células inmunes desempeñan un papel integral afectando el éxito de la función reproductiva. Dehecho, una disfunción inmune ha sido identificada como uno de los mecanismos principalesrelacionados a la infertilidad1. Particularmente, los macrófagos son derivados de monocitos circulantesque migran hacia los tejidos atraídos por el factor estimulante de colonias-1 (CSF-1) y la proteínaquimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) producidos por células parenquimatosas en respuesta a laestimulación hormonal. Son las células inmunitarias más abundantes dentro del ovario, se han localizadoen la teca de folículos en desarrollo y atrésicos en tejidos lúteo e intersticial, tanto en animales como enhumanos. Su distribución fluctúa a lo largo del ciclo ovárico con los números más altos presentes en elproestro y el diestro, indicando la marcada influencia de las hormonas en la cinética de reclutamientode los macrófagos al ovario2. Estas células inmunes son importantes para la función reproductiva normaldebido a que están en contacto con otras células e influyen en sus funciones a través de la producciónde citoquinas, factores de crecimiento, etc.3.Muchos trabajos utilizan monocitos aislados de sangre periférica para realizar experimentos in vitro paraevaluar la actividad de macrófagos. Sin embargo, hemos comprobado al igual que otros autores4, queesta técnica tiene ciertas desventajas debido a que la purificación de monocitos de la población de célulasmononucleares es algo laboriosa y que la función de estas células depende del estado de los donantes enel momento de la extracción de sangre. Por lo tanto, utilizar este modelo experimental para evaluarfuncionalidad de macrófagos puede plantear un problema real. Estos hechos nos llevaron a la búsquedade una línea celular que reemplace el uso de estas células derivadas de monocitos. Un grupo deinvestigadores desarrollaron una línea celular de macrófagos bovinos (BoMac) derivados de macrófagosperitoneales4. Este grupo de trabajo realizó una amplia caracterización de esta línea BoMac en loreferente a capacidad fagocítica, citotoxicidad celular (dependiente e independiente de anticuerpos),producción de radicales de oxígeno y producción de IL-6 en respuesta a un estímulo activador4.En nuestro grupo de trabajo, nos planteamos el estudio in vitro de la interacción de las células de lagranulosa bovina (línea celular BGC-1) con las células BoMac, para evaluar la interacción del sistemainmune con células propias del ovario. A su vez, para estos ensayos in vitro, tenemos planteados diversosestímulos hormonales, y para poder llevarlos a cabo evaluamos la expresión de los receptores de lashormonas de interés en las BoMac para su uso posterior. Es por todo lo descripto que nos planteamoscomo objetivo de este trabajo caracterizar en las células BoMac la expresión de los siguientes receptores:receptor de glucocorticoides (GR), receptor 2 de melanocortinas (MC2R), receptor de estrógenos α(ERα), receptor de estrógenos β (ERβ) y receptor de progesterona (PR).Para llevar a cabo este objetivo sembramos las células BoMac en botellas de 25 cm2 a una concentraciónde 200.000 células/ml en medio completo (RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific), L-glutamina2 mM, suero bovino fetal al 10%, antibiótico-antimicótico 1X). A continuación, incubamos a 37°C enuna atmósfera humidificada con CO2 al 5%. Una vez en confluencia, las células fueron removidas delas botellas raspando las mismas con un scraper. Luego se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer con el colorante de exclusión azul de Tripán para conocer la concentración celular.Posteriormente, las células fueron centrifugadas durante 10 minutos (min) a 800 g, y el pellet celularfue resuspendido en buffer fosfato salino (PBS) 1X de manera tal de obtener una concentración celularde 500.000 células/ml. Seguidamente la suspensión celular fue citocentrifugada utilizando lacitocentrífuga Cyto-Tek Sakura, los portaobjetos (50.000 células/portaobjetos) fueron almacenados a -20°C hasta la realización de la técnica de inmunocitoquímica indirecta para la detección de losreceptores hormonales previamente mencionados. Brevemente, los portaobjetos conteniendo las célulasse fijaron en metanol frío y luego se permeabilizaron con tritón X-100 0,2% durante 10 min. Acontinuación, se incubaron con el anticuerpo primario (ver tabla) durante toda la noche a 4 °C. Comocontrol negativo se omitió el anticuerpo primario, realizándose la incubación con PBS-albúmina séricabovina (BSA) durante toda la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando el kit CytoScan HRPDetection System (Cell Marque) y 3,3-diaminobencidina (DAB, Thermo Fisher Scientific) comocromógeno. Finalmente, los portaobjetos se lavaron con agua destilada, se contracolorearon conhematoxilina y se realizó el montaje. En la figura se muestran imágenes representativas de todos los receptores evaluados obtenidas usandouna cámara digital Nikon DS-Fi2 (Tokyo, Japan), acoplada a un microscopio óptico Nikon Eclipse Niutilizando un objetivo de 40X de aumento. Para todos los receptores observamos inmunomarcaciónespecífica citoplasmática, y para el caso particular de MC2R se observó una inmunomarcaciónespecífica de la membrana celular, además de la marcación citoplasmática. Estos resultados preliminares son de suma importancia para el desarrollo de nuestro trabajo a futuro,pudiendo plantear el uso de la línea celular BoMac para diversos estudios en la fisiopatología de lareproducción. Puntualmente podremos desarrollar ensayos de co-cultivo de esta línea celular con lasBGC-1 y así relacionar esos resultados con los hallados en el modelo in vivo.