Evaluación de la utilidad de sparfloxacina como tratamiento contra Mycoplasma spp. en la línea celular de granulosas bovinas (BGC-1).

ETCHEVERS L; STASSI A.F.; CATTANEO MOREYRA ML; RODRIGUEZ, F.M.; CHIARAVIGLIO, JA; OLMOS NICOTRA F; DÍAZ, P.U.; ORTEGA, H.H.; REY, F.; SALVETTI, N.R.; AMWEG, A.N.

Jornada; IX JORNADA DE DIFUSIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y EXTENSIÓN; 2021

El uso de líneas celulares como herramienta para el estudio funcional de genes y proteínas como asítambién para la producción de sustancias bioactivas requiere un control de calidad riguroso paraexcluir la contaminación con microrganismos1. En este sentido, la contaminación con micoplasmasresulta importante debido a su alta incidencia.Los micoplasmas son un grupo de microorganismos que pertenecen a la clase Mollicutes y secaracterizan por su pequeño tamaño y la ausencia de pared celular. La contaminación conmicoplasmas genera múltiples efectos sobre las células eucariotas en cultivo ya que son capaces dealterar casi todos los parámetros celulares: proliferación, vías de señalización, vías enzimáticas,antígenos de la membrana plasmática e, inclusive, propiedades del genoma, transcriptoma y proteomade las células huésped1,2. Además, debido a la competencia y agotamiento de nutrientes esencialespresentes en el medio de cultivo, se altera la capacidad de síntesis de proteínas, ADN y ARN. Dichasalteraciones influyen considerablemente en los resultados obtenidos, resultando además en pérdidaseconómicas. En conclusión, para el desarrollo y uso de sistemas de cultivos de líneas celulares resultaprimordial contar con líneas libres de la contaminación con Mycoplasma spp.Dentro de los métodos utilizados para eliminar Mycoplasmas spp. de los cultivos celulares se incluyenmétodos físicos, químicos, inmunológicos y basados en antibióticos. Sin embargo, los métodos deeliminación de estas bacterias idealmente deberían ser simples, rápidos, eficientes, confiables yeconómicos. También, deberían tener efectos mínimos sobre las células eucariotas cultivadas2. En esesentido, se ha demostrado que cuatro clases de antibióticos son muy eficaces en el tratamiento demicoplasmas: tetraciclinas, pleuromutilinas, macrólidos y fluoroquinolonas. Estos antibióticos puedenusarse en concentraciones relativamente bajas, con baja probabilidad de desarrollo de resistencia y conefectos bajos o nulos sobre las células eucariotas.El objetivo del presente trabajo consistió en evaluar la efectividad de dos tratamientos antibióticoscontra Mycoplasma spp. y su posible efecto sobre las características fenotípicas de la línea celularBGC-1 (Bovine Granulosa Cell 13). Para ello, las células contaminadas con Mycoplasma spp fueronmantenidas en frascos T25 al 80% de confluencia en medio Dulbecco's Modified Eagle Medium F-12(DMEM-F-12, Gibco) suplementado con suero fetal bovino 20%. En caso de ser necesario, las célulasfueron subcultivadas para asegurar la confluencia del 80%. El tratamiento 1 consistió en aplicarsparfloxacina (Sigma-Aldrich) 10 μg/ml cada 24 h durante 7 días consecutivos. Por el otro lado, eltratamiento 2 consistió en adicionar a las células sparfloxacina 10 μg/ml cada 48 h durante 14 díasconsecutivos. La eficacia del tratamiento se evaluó mediante reacción en cadena de la polimerasa(PCR) de punto final una vez finalizado el tratamiento (día 0 postratamiento) y 7, 14, 21 y 28 díaspostratamiento (pt). Para ello, alrededor de 2x105 células fueron recogidas en PBS y luego sembradasen la PCR utilizando un set de cebadores específicos4. Además, 5x105 células fueron fijadas en unportaobjeto utilizando una citocentrífuga y, posteriormente, sometidas a inmunocitoquímica (ICQ)para la evaluación de la expresión de la enzima aromatasa (CYP19A1). Brevemente, las células sefijaron en metanol frío y, luego, se permeabilizaron con tritón X-100 0,2% durante 10 min. A continuación, se incubaron con el anticuerpo primario (CYP19 clon H-300, sc-30086, Santa CruzBiotechnology) durante toda la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando el kit CytoScan HRPDetection System (Cell Marque) y 3,3-diaminobencidina (DAB, Thermo Fisher Scientific) comocromógeno. Finalmente, los portaobjetos se lavaron con agua destilada, se contracolorearon conhematoxilina y se realizó el montaje.El tratamiento 1 resultó efectivo el día 0 pt. Sin embargo, 7 días pt volvió a ser detectada la presenciade Mycoplasma spp. en la línea celular. Por otro lado, el tratamiento 2 resultó ser efectivo luego de los14 días de aplicación y logró mantener a la línea libre de contaminación los días 7, 21 y 28 pt (fig. 1). En los cultivos donde resultó efectivo el tratamiento, se evaluó la expresión de la enzima CYP19A1,como marcador fenotípico característico de la línea. Los resultados de la ICQ mostraron que eltratamiento no alteró la expresión de la enzima aromatasa (fig. 2). En conclusión, se pudo realizar un tratamiento antibiótico efectivo para descontaminar la línea celularBGC-1. Además, el tratamiento no alteró la característica fenotípica principal de la población celular.Estos resultados nos permiten contar con un sistema in vitro para el desarrollo de modelosexperimentales y la evaluación de diferentes vías de interés asociadas a la reproducción bovina.