Caracterización de la línea celular de granulosas ováricas bovinas BGC-1: detección de diferentes marcadores de funcionalidad

CATTANEO MOREYRA ML; ETCHEVERS L; STASSI A.F.; CHIARAVIGLIO J; VILLALBA, L; AMWEG, A.N.; ORTEGA, H.H.; SALVETTI, N.R.; RODRIGUEZ, F.M.; REY, F.

Jornada; IX JORNADA DE DIFUSIÓN DE LA INVESTIGACIÓN Y EXTENSIÓN; 2021

En el período posparto temprano de las vacas lecheras ocurre un rápido aumento de los requerimientosnutricionales, que no alcanza a ser cubierto mediante la ingesta. Éste aumento de los requerimientos denutrientes necesarios para la lactancia provoca un desequilibrio energético durante el período pospartotemprano que puede durar varias semanas después del parto3. En este contexto, se genera un aumentode la lipomovilización, la gluconeogénesis y la oxidación de ácidos grasos. Consecuentementeincrementan las concentraciones de ácidos grasos no esterificados y β-hidroxibutirato circulantes, paraser utilizados como fuente energética alternativa de los tejidos no mamarios y direcciona la glucosahacia la glándula mamaria. Frente a esta situación, se desvían los nutrientes y afecta a la reproducción2,limitando el número de folículos ováricos, el crecimiento y el tamaño máximo del folículo dominante,retrasa la primera ovulación e interfiere con el proceso ovulatorio. En ese sentido, se ve favorecido eldestino del folículo dominante hacia la persistencia folicular y posible desarrollo de la enfermedadquística ovárica (COD; del inglés Cistyc Ovarian Disease).En nuestro laboratorio hemos desarrollado un modelo de persistencia folicular en bovinos lecheros queconsiste en la administración de dosis subluteales de progesterona (P4) utilizando un dispositivointravaginal1. En este modelo in vivo se determinó que el tratamiento con P4 inhibe el pico preovulatoriode hormona luteinizante (LH) en las vacas tratadas y altera los niveles de 17β-estradiol (E2), P4, 17-hidroxiprogesterona y testosterona en suero y líquido folicular, similar a lo observado en vacas conCOD. Para ampliar los conocimientos que determinan una persistencia folicular, nos propusimosdeterminar la expresión de distintos marcadores relacionados con la esteroidogénesis, como indicadoresde funcionalidad ovárica, en las células de la granulosa. En este sentido los análisis in vitro de cultivoscelulares son útiles para complementar los resultados del modelo in vivo. Para ello, nos plantemos comoobjetivo determinar la presencia de: la enzima citocromo P450 aromatasa (CYP19), 3β-hidroxiesteroidedeshidrogenasa (3β-HSD), el receptor de progesterona (PR), y receptores de estrógenos (ERα y ERβ)en la línea de células de la granulosa bovina BGC-1. Las células provenientes de una línea celular de lagranulosa bovina (BGC-1), cedidas por el Dr. Lino Barañao del Instituto de Biología y MedicinaExperimental (IBYME, CONICET), se cultivaron en un medio DMEM:F12 (Gibco) completo(suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 1% de antibiótico). Al alcanzar el 80% deconfluencia en un frasco T25, se realizó el recuento celular en cámara de Neubauer con el colorante deexclusión azul de Tripán. En placas de 24 pocillos, se sembraron pocillos con 100.000 y 50.000 célulasy se incubaron por 24 y 48 h respectivamente. Las células se trataron con diferentes concentraciones degonadotropina sérica de yegua gestante (PMSG, del inglés pregnant mare's serum gonadotropin): 1, 5 y10 UI/ml. Se incorporaron controles sin PMSG en los tiempos estudiados. Una vez finalizado el ensayo,se retiró el medio de cultivo y se colectaron las células. Para ello, previamente se lavaron con 200 μl debuffer fosfato salino (PBS) y se trataron con 100 μl de tripsina a 37°C y deteniendo la rección con 200μl del medio de cultivo completo. Las células se centrifugaron y el pellet de células obtenido seresuspendió en 400 μl de PBS. Luego las células fueron adheridas a portaobjetos mediantecentrifugación (citocentrífuga Cyto-Tek Sakura), para realizar posteriormente la técnica deinmunocitoquímica indirecta. Para ello, las células (100 μl/portaobjetos) se fijaron en metanol frío y,luego, se permeabilizaron con tritón. A continuación, se incubaron con los anticuerpos primarios comose indica en la tabla 1, durante toda la noche a 4 °C. Como control negativo se omitió el anticuerpoprimario, realizándose la incubación con una solución de PBS y albúmina sérica bovina (PBS-BSA)durante toda la noche a 4 °C. La detección se realizó utilizando el kit comercial compuesto poranticuerpos polivalentes biotinilados y estreptavidina marcada con peroxidasa (CytoScan HRPDetection System, Cell Marque) y se utilizó como cromógeno 3,3-diaminobencidina (DAB, ThermoFisher Scientific). Luego, las células se contracolorearon con hematoxilina y se realizó el montaje concubreobjetos. Se obtuvieron imágenes de los preparados citológicos que fueron digitalizadas medianteuna cámara color de video CCD (Motic 2000, Motic China Group, China) montada a un microscopiode luz convencional (Olympus BH2, Olympus Co., Japan).Como resultado, se observó la inmunomarcación específica en el citoplasma de las células que indica lapresencia de todas las moléculas analizadas en las mismas. (Figura 1).Estos resultados nos permitirán avanzar con los cultivos de las células BGC-1 frente a distintos estímulosrelacionados al metabolismo de lípidos capaces de alterar la funcionalidad de los folículos, como laesteroidogénesis, útiles para comprender mecanismos relacionados a la persistencia folicular ycomplementar los resultados del modelo de persistencia in vivo.