Desarrollo de una nueva plataforma para la expresión y purificación de lactoferricina bovina recombinante.

URTASUN, NICOLÁS; BAIELI, MARÍA FERNANDA; ROMASANTA, PABLO; FERNÁNDEZ, M.M.; MALCHIODI, E.L.; CASCONE, OSVALDO; WOLMAN, FEDERICO JAVIER; MIRANDA, MARÍA VICTORIA

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; ETIF 2012, 7º Congreso y Exposición para la producción farmacéutica, biotecnológica y veterinaria; 2012

La lactoferricina bovina (Lfcin B) es un péptido catiónico de peso molecular de 3124 Da que deriva de la fracción pHe17-Phe41 del extremo amino de la lactoferrina (Lf) bovina y constituye un potente antibacteriano. Exhibe mayor actividad específica que la lactoferricina humana, murina o caprina. Además, presenta actividad antifúngica, antiviral, insecticida, antiparasitaria, antitumoral y posee efectos sinérgicos con varios medicamentos convencionales. La principal fuente de obtención de la Lfcin B es por hidrólisis con la enzima pepsina de la Lf bovina previamente purificada del sero de queso. Por otra parte. , la expresión recombinante de la Lfcin B en Escherichia coli o Pichia methanolica resulta tóxica para estos microorganismos. En este trabajo, se estudió la expresión de Lfcin B y Lfcin B fusionadaa glutatión-S-transferasa (Lfcin B-GST) en el sistema baculovirus/células de insecto. Al ser dirigida la expresión de Lfcin B-GST al medio de cultivo se obtuvo un rendimiento de 13.72 ± 0.01 mg/l de cultivo (1.12 ± 0.01 mg de Lfcin B/l) mientras que al ser acumulada en citoplasma se obtuvo un rendimiento de 17.95 ± 3.86 mg de Lfcin B-GST/l de cultivo (1.93 ± 0.41 mg de Lfcin B/l). Estos valores resultaron ser aproximadamente 10 veces mayores con respecto a la expresión del pétido son la proteína de fusión GST. Se midió la afinidad de la Lfcin B a 5 colorantes triazínicos por Resonancia Plasmática de Superficie (Biacore, GE) con el fin de seleccionar alguno de ellos como posibles ligandos de aplicación para su purificación. El colorante Yelloe HE-4R (Kd= 1.1 ± 0.3x10-7 M) fue el que mostró la mayor afinidad por Lfcin B seguido del Red HE-3B (Kd= 1.6 ± 0.4x10-5 M). Estos ligandos fueron inmovilizados sobre Sepharose 4B y se realizaron ensayos de purificación en batch de Lfcin B-GST a partir de sobrenadantes de células de insecto sf9. Los procesos de purificación se realizaron sin previo acondicionamiento del medio de cultivo (pH 6.4; conductividad 7 ms/cm) con las matrices Yellow Sepharose y Red Sepharose. El mayor rendimiento -65%- se logró con la matriz Yellow Sepharose al utilizar 2 M de NaCl con 25% de etilenglicol, pH 10 como eluyente. Dada la viabilidad del sistema baculovirus/células de insecto para la correcta expresión del péptido recombinante se espera incrementar los niveles de producción mediante el traslado del proceso a larvas de lepidópteros. Este esquema productivo, acoplado al uso de colorantes triazínicos como ligandos de afinidad para la purificación del péptido, tiene la ventaja de su bajo costo por sobre otras tecnologías en uso.