Estudio funcional de la Gtpasa pequeña RhoD: desarrollo de un biosensor basado en FRET

VALLETTO, G; MARTIN, J; QUASSOLLO, G; BISBAL, M

Córdoba

Jornada; XXIV jornadas científicas de la Sociedad de Biología de Córdoba.; 2021

Sociedad de Biología de Córdoba

Las Rho GTPasas constituyen una distinguida familia de proteínas pertenecientes a la superfamilia de GTPasas pequeñas relacionadas a Ras. Dentro de esta gran familia de Rho GTPasas existen dos tipos funcionales, las clásicas y las atípicas. Las más conocidas y estudiadas corresponden al primer grupo, con representantes tales como RhoA, Rac1 y Cdc42 que son mediadas por reguladores de actividad llamados GEF, GAPS Y GDIS.Dentro del grupo de las Rho GTPasas atípicas tenemos a RhoD. La familia RhoD/Rif tiene una mayor actividad de intercambio intrínseco de GTP. RhoD tiene un importante rol en la organización y regulación de la dinámica del citoesqueleto de actina, y también se ha observado la importancia de su actividad en la homeostasis del Aparato de Golgi (AG). Asimismo, resultados de nuestro laboratorio sugieren que la actividad de RhoD regula la formación axonal y la extensión de neuritas. Los datos disponibles indican que la GTPasa atípica RhoD es un importante regulador de la reorganización y comunicación del citoesqueleto y del tráfico anterógrado de membrana con vías de señalización y efectores distintos a los observados para las Rho GTPasas clásicas. Sin embargo, poco se conoce sobre los patrones espaciotemporales de la actividad de esta proteína ya que debido a su naturaleza de ciclado rápido, la pequeña fracción activa del total que se encuentra en la célula, y la gran proporción que existe acumulada en el citosol, la distribución intracelular no representa fehacientemente la cantidad de proteína activa en la célula. El desarrollo de biosensores basados en la transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET) soluciona este problema ya que permiten diferenciar la porción de proteína activa sobre la inactiva. La técnica de FRET se basa en la transferencia de energía no radiativa entre dos fluoróforos, uno donor y otro aceptor, donde la distancia entre ambos es de rango nanométrico. De esta forma, al ser excitado el fluoróforo donor, éste emite energía a una longitud de onda que se superpone con la longitud de onda de excitación del fluoróforo aceptor. En este contexto, el objetivo general de este trabajo fue diseñar y desarrollar un biosensor basado en FRET que nos permita estudiar la dinámica y los patrones espacio-temporales de actividad de la GTPasa pequeña RhoD. Para llevarlo a cabo, se diseñó, desarrolló y caracterizó un plásmido de expresión en eucariota con un biosensor unimolecular de actividad para RhoD. En conclusión, pudimos desarrollar una poderosa herramienta para medir la actividad de la GTPasa pequeña RhoD, el cual nos permitió distinguir la población subcelular de RhoD activa por sobre la inactiva, e identificar patrones de actividad temporal de la misma en respuesta ante estímulos externos. Este tipo de tecnología permite no solo un análisis más adecuado para estudiar la forma de funcionamiento de esta GTPasa, sino que también provee una serie de ventajas dentro de las cuales se encuentra la facilidad en su medición dado su naturaleza de biosensor unimolecular.