Interaccion entre el motor microtubular KIF4 y la fosfoproteina ribosomal P0 en dominios subcelulares

BISBAL M,PERETTI D, CÁCERES A

Vaquerias

Taller; V TALLER ARGENTINO DE NEUROCIENCIAS; 2003

Las células polarizadas presentan asimetrias estructurales y funcionales generadas y mantenidas por el sistema citoesqueletal y por su transporte selectivo, activo y continuo de materiales a sus destinos finales, los cuales son fundamentales para el mantenimiento de la morfología celular y su correcto funcionamiento. La mayor parte los materiales son transportados en organelas vesiculares o en complejos proteicos llevados por proteinas motoras como kinesinas,  dineinas y miosinas.Un miembro de la superfamilia de las kinesinas, el motor microtubular anterogrado KIF4, presenta tres dominios: un dominio motor conservado NH2-terminal, un dominio central alfa-helice el que permite formar el homodimero a través de una estructura coiled-coil, y la cola COOH-terminal donde se encontraría el sitio de unión al cargo. Este motor se expresa en diversos tejidos juveniles; en neuronas en desarrollo, se encuentra enriquecido en conos de crecimiento axonal.Poco se conoce sobre las interacciones de los motores microtubulares con su(s) cargo(s) y la regulación, siendo este un aspecto central para entender la biología de estas proteínas y del transporte, hecho crucial en el establecimiento de la polaridad celular.Con el objeto de identificar algunas posibles interacciones de la region carboxilo terminal del motor microtubular KIF4, con proteínas que participen en la unión al cargo, utilizamos la técnica del doble híbrido. Esta técnica de biología molecular se basa en un ensayo transcripcional in vivo en levaduras, que permite la identificación precisa de interacciones entre una proteína conocida de interés (en nuestro caso KIF4) con proteínas de una librerías de ADNc  de cerebro de ratón.Con el empleo de este ensayo identificamos a la fosfoproteina ribosomal P0, componente estructural de la subunidad mayor (60s) del ribosoma, como una interacción directa del dominio C-terminal de KIF4 en este sistema. Para confirmar esta interacción en células en proceso de polarización se realizaron experimentos bioquímicos de co-inmunoprecipitacion en preparaciones de conos de  crecimiento y estudios de sobre-expresión en cultivo de células MDCK no confluentes mediante inmunofluorescencia. Estos experimentos muestran una interacción entre una proteína de la maquinaria de síntesis proteica (P0) con un motor microtubular (KIF4) en regiones como conos de crecimiento de neuronas y borde de avance (leading edge) de células MDCK  donde el citoesqueleto tanto de actina como de tubulina participan en eventos claves para la polarización celular. Análisis posteriores  permitirán conocer  la importancia funcional de esta interacción en la generación y/o mantenimiento de la polaridad celular así como en otros procesos.