DEFICIENCIA DE ANDROGENOS: ¿UNA DE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE LAS PATOLOGIAS PULMONARES?

PACHECO GUIÑAZU ANAHI BELEN; BIAGGIO VERONICA SILVINA; CIMINARI MARIA EUGENIA; VALDEZ SUSANA R; ALVAREZ-OLMEDO DAIANA; PIGUILLEM SILVANA; PEREZ CHACA MARIA VERONICA; ALVAREZ SILVINA MONICA; GOMEZ NIDIA NOEMI

San Luis

Congreso; VIII Congreso Nacional de Estudiantes de Bioquímica, Biotecnología y Biología Molecular.; 2013

Universidad Nacional de San Luis

DEFICIENCIA DE ANDROGENOS: ¿UNA DE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE LAS PATOLOGIAS PULMONARES? Pacheco Guiñazu AB, Biaggio VS, Ciminari ME, Valdez SR, Álvarez-Olmedo DG, Piguillem SN, Pérez Chaca MV, Álvarez SM, Gómez NN. Introducción: La población de adultos mayores, formada por las personas de más de 65 años, es en la actualidad el grupo de crecimiento más rápido. Una gran parte de esta población está constituida por varones ancianos cuyos cambios hormonales, en particular la deficiencia de andrógenos, constituyen hoy en día un tema de gran interés tanto para el público en general, como para la comunidad médica. En el varón, la producción de los esteroides sexuales tiene lugar en los testículos y en las glándulas suprarrenales. La testosterona es el esteroide con capacidad androgénica más importante, el cual se sintetiza mayoritariamente en las células de Leydig del testículo (95%). El resto (5%) se sintetiza a nivel periférico, a partir de la androstenodiona producida en la corteza suprarrenal (androstenodiona y DHEA-s) y a la transformación periférica de la testosterona. La testosterona se encuentra en el plasma bajo tres formas: unida con alta afinidad a la globulina transportadora de hormonas sexuales (SHBG) o también denominada globulina transportadora de testosterona y estradiol (TeBG), unida débilmente a la albúmina y otras proteínas plasmáticas y por último, una mínima proporción se encuentra en forma de testosterona libre. Sólo la fracción de testosterona libre, (aproximadamente entre el 1 y 3% de la testosterona total) es capaz de penetrar en las células diana. Las hormonas esteroideas masculinas tienen mecanismos de acción mediados por su receptor específico denominado receptor de andrógenos (RA). El receptor de andrógenos pertenece a la superfamilia de los receptores de localización nuclear. En ausencia de ligando, el RA se encuentra unido a proteínas que estabilizan su estructura terciaria y previenen su activación. La unión del receptor con los andrógenos provoca una disociación de estas proteínas, fosforilación del RA, interacción con los elementos respuesta de los andrógenos y activación de la trascripción de los genes regulados por los andrógenos. Los receptores nucleares modulan la transcripción reconociendo específicamente secuencias de nucleótidos denominados elementos de respuesta hormonal (ERH). La formación de dímeros de los receptores nucleares condiciona la eficiencia de la unión del receptor a sus ERH. A través de estas secuencias (ERH) el RA activa los genes de respuesta androgénica. Estas hormonas poseen una acción androgénica, ya que favorecen el crecimiento y desarrollo del aparato reproductor masculino y son responsables de los caracteres sexuales secundarios y una acción anabólica, ya que promocionan el crecimiento muscular, óseo, somático y regulan el desarrollo del pulmón durante el período neonatal. (Hoberman y Yesalis, 1995; Bagatell y Bremner, 1996). Existen múltiples causas que llevan a la disminución de los niveles de andrógenos con la edad, viéndose influenciadas por factores psicosomáticos, enfermedades orgánicas y fármacos. Las enfermedades médicas coexistentes pueden afectar adversamente a la producción de andrógenos dado que el descenso de la producción de los mismos relacionado con la edad es más pronunciado en pacientes con obesidad, diabetes, enfermedad coronaria, depresión y en fumadores (Deslypere y Vermeulen, 1984). Sin embargo no existen estudios extensivos y moleculares que analicen la relación entre los niveles de andrógenos en pulmón, a largo plazo y la homeostasis entre oxidantes/antioxidantes, ni se ha determinado si existe alguna relación entre la castración o disminución de andrógenos severa y la regulación de la respuesta del sistema inmune pulmonar ante un agente patógeno. Por último, se sabe que el estrés oxidativo se presenta como resultado de un desbalance entre oxidantes y antioxidantes, ya sea por exceso de oxidantes o por depleción de los antioxidantes. La evidencia sostiene que la producción de radicales libres lleva a un una situación de estrés y que éste juega un papel importante en la fisiopatología de enfermedades pulmonares, no solo a través de daño directo, sino también por estar implicado en el control de los mecanismos inflamatorios pulmonares (MacNee, 2000). La generación persistente de especies reactivas del oxigeno (ERO), tales como superóxido, agua oxigenada e hidroxi-radicales es una consecuencia inevitable de la respiración mitocondrial, en organismos aeróbicos. La inducción de altos niveles de EROs puede dañar el ADN, proteínas y lípidos y conducir a la senescencia y muerte celular, entre otras consecuencias. Los lípidos poli-insaturados de las membranas celulares son el principal blanco del ataque por radicales libres, lo que lleva a un aumento de la peroxidación lipídica. La respiración mitocondrial es el mayor recurso de EROs, los que también son producidos por una familia de enzimas unidas a membrana conocidas como NADPH oxidasas (Noxs). Diferentes Noxs son expresadas en diferentes tipos celulares y poco es conocido acerca de su expresión. Las células están equipadas con múltiples mecanismos de defensa antioxidante. La primera línea de defensa incluye a la enzima superóxido dismutasa (SOD), que convierte superóxido en agua oxigenada, la que a su vez puede ser convertida en radical hidroxilo, que puede dañar macromoléculas. Para ello todas las células están equipadas con múltiples vías enzimáticas para su remoción, entre ellas: glutatión peroxidasa (Gpx) y catalasa (Gómez y col., 2003). La posibilidad de hallar un cuadro de estrés oxidativo en nuestro modelo nos hizo pensar que tal situación de injuria podría alterar la expresión de algunos marcadores de inflamación, como también de apoptosis. Se conoce que Bcl-2, es una de las proteínas claves en la cascada apoptótica, la misma participa inhibiendo dicho proceso. Además se ha observado que el incremento en la relación Bax/Bcl-2 sería un indicador de apoptosis a nivel de las células epiteliales alveolares (Kazuyoshi, 2007). Existen varias investigaciones que demuestran una clara vinculación entre el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA) y la expresión de Bcl-2, en determinados modelos en donde se evalúa el grado de proliferación celular y la susceptibilidad del tejido para desarrollar un tumor maligno (Gordón-Nuñez y col. 2008). Ante esta información decidimos evaluar la expresión de PCNA. Por otro lado, las proteínas de shock calórico (Hsps) han sido ampliamente usadas como biomarcadores para determinar los efectos fisiológicos de factores exógenos tales como microorganismos, químicos, malnutrición, etc. Las Hsps son un grupo de proteínas chaperonas que pueden ser activadas ante una gran variedad de tipos de estrés. Estas proteínas actúan mediante mecanismos citoprotectores, incrementado su expresión en las células. De hecho, la Hsp 27 ejerce funciones antiapoptóticas, ya que actúa a nivel de la caspasa-3 (Wu y col. 2011). Se conoce también que la sobre-expresión de las Hsps pueden conferir a las células protección ante mecanismos apoptóticos, principalmente durante la diferenciación de monocitos a macrófagos (Wu y col. 2011). En este trabajo se estudiaron los cambios en el sistema de defensa antioxidante en el pulmón, como consecuencia de una deficiencia de andrógenos a largo plazo. Para ellos se determinaran los niveles de lipoperoxidación, como un índice del estrés. Así también, se determinará la expresión de Noxs y los cambios en la regulación de la expresión de las enzimas antioxidantes. Para ello, determinamos los ARNm de las enzimas: superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), así como la expresión del factor nrf-2, que regula la expresión de las enzimas antioxidantes. Por último, se administró testosterona a los animales castrados durante 5 días previos al sacrificio, para observar si alguno de los efectos observados por la deficiencia de andrógenos se revierte o disminuye. También se estudió la expresión de algunas proteínas de shock calórico (Hsps), y de bcl-2 y PCNA por técnicas inmunohistoquimicas. Objetivo: Determinar los efectos de la deficiencia de andrógenos sobre el sistema de defensa en pulmón de rata y analizar los cambios que ocurren en la histoarquitectura como consecuencia de los mismos. Métodos: Se trabajo con ratas machos de la cepa Wistar, adultas de 200±20 g de peso. Las mismas fueron separadas en tres lotes: - Un lote control (Control) - Un segundo lote problema, el cual fue sometido a castración quirúrgica (Castrados). - Un tercer lote problema, el cual también fue sometido a castración quirúrgica y cinco días previos al sacrificio recibió Testosterona vía inyección intraperitoneal (Castrados + Testosterona). Todos los lotes fueron mantenidos en cajas individuales y se mantuvieron con ingesta diaria de agua y comida. Se controlo el peso corporal semanalmente. Luego de 30 días de tratamiento, los animales fueron sacrificados, previa anestesia. Se procedió rápidamente a la extracción del surfactante, mediante canulación de la tráquea y posterior extracción a través de lavados broncoalveolares (LBA), usando solución fisiológica. A partir del LBA se separaron los macrófagos alveolares y el surfactante pulmonar. Así mismo, se extrajo el estroma pulmonar que fue sumergido en N2 líquido y posteriormente guardado a ?70 C hasta su procesamiento. Se determino el grado de lipoperoxidación en suero y tejido pulmonar a través de la técnica de TBARS (sustancias reactivas al acido tiobarbitúrico). Se cuantifico el nivel de proteínas totales en LBA por el método de Lowry, usando albúmina bovina como estándar. En suero también se midió la concentración de nitritos por el método de Griess. Las muestras de pulmón fueron homogeneizadas con un homogeneizador Ultraturrax, tomando todas las precauciones necesarias para evitar la degradación del tejido. La extracción de ARN se llevo a cabo empleando el reactivo comercial TRIzol (GIBCO ? Life Technologies), según las instrucciones del fabricante. La cantidad y pureza del ARN obtenido se cuantifico por espectrofotometría a 260 nm y a 280 nm. Se realizó RT-PCR semicuantitativa para cuantificar los distintos genes de interés. Se obtuvo el ADN copia utilizando hexámeros al azar. La expresión de los genes se cuantifico a través de la amplificación con primers específicos: RA, nrf-2, CAT y SOD. Se utilizo S28 como gen control. Para el estudio de microscopía los tejidos fueron deshidratados, para luego ser incluidos en parafina. Se utilizaron los anticuerpos: Hsp 27, Hsp 70i, PCNA y Bcl-2. Cada anticuerpo fue ensayado en al menos tres secciones diferentes de pulmón. Las imágenes fueron analizadas con el programa Image Pro Plus 3.0.1. El análisis estadístico se hizo utilizando el test de ANOVA. Resultados En los lavados broncoalveolares de las ratas castradas se observó un incremento en el nivel de proteínas (p