ASPECTOS MORFOLÓGICOS DE TELIOSPORAS DE THECAPHORA FREZII

FIGUEROA A.C. ; DIAZ M.S.; ALASINO R.V.; BELTRAMO D.M

Jornada; XXXVI Jornada Nacional de Maní; 2021

IntroducciónEl cultivo de maní es afectado por numerosas enfermedades, entre ellas el carbón del maní causado por el hongo Thecaphora frezii. Una de las principales dificultades para el estudio de este hongo es la escasa germinación in vitro de las teliosporas, lo que no permite conocer fehacientemente su viabilidad. Además, se conoce muy poco acerca de la biología de la infección. Estudios previos realizados en el laboratorio, demostraron que estas esporas no se tiñen con calcoflúor, colorante fluorescente que se une a quitina y celulosa, mientras que el micelio si se coloreó. Considerando que quitina es un componente habitual de la pared de los hongos y que en otras especies fúngicas se conoce que la quitina está cubierta o dispuesta de manera tal que no es visible mediante microscopia, es que nos planteamos indagar sobre la estructura de las teliosporas. Inicialmente abordamos el estudio sobre la morfología para luego avanzar con la composición de estas.Materiales y MétodosLas esporas se obtuvieron de cajas de maní con síntomas de la enfermedad. Se desinfectaron superficialmente y el pellet húmedo se separó en dos partes. Una parte se dejó intacta y la otra se rompió con mortero y N2 líquido para estudiar la estructura interna de las esporas. Las muestras fueron derivadas al laboratorio LAMARX para su secado con CO2 en punto crítico y metalizado con oro. Luego se realizó un análisis por SEM con aumentos de 5000X a 30000X. Se tomaron registros fotográficos de las estructuras fúngicas. Se utilizó quitina comercial como control, se observó su estructura microscópica y comparó con la estructura de la pared de las esporas. Para comenzar con los estudios de composición de la pared, las esporas rotas se sometieron a una centrifugación diferencial con un gradiente de sucrosa (80%-60%-40%). Estas esporas se separaron en dos capas diferenciales del gradiente, ambas se aislaron y fueron observadas en microscopio óptico. La capa enriquecida con las esporas rotas se hidrolizó en HCl concentrado y calor (120°C) durante toda la noche. El producto de hidrólisis fue neutralizado y se analizó la presencia de polisacáridos mediante la técnica de Fehling. La misma detecta la presencia de azucares libres, cuyos grupos reductores reaccionan con el Cobre dando un precipitado rojo.ResultadosConsiderando la baja germinación in vitro de las teliosporas y que no hay estudios previos acerca de su estructura es que nos planteamos como objetivo inicial estudiar su morfología, no sólo en su parte externa sino también la composición de su pared, lo que nos permitiría abordar nuevas estrategias de control.Para ello, comparamos esporas enteras y rotas y las cotejamos, además, con una muestra de quitina comercial. A 5000X observamos que la quitina se dispone en capas escalonadas. A mayor aumento (30000X) se puede observar que está compuesta por fibras longitudinales entramadas. Cuando analizamos las esporas enteras a menor aumento, observamos en la superficie una organización del tipo cónica y en capas, sin embargo, en un aumento mayor, no se vio la disposición de fibras longitudinales de quitina. Estos resultados sugieren que esta capa tiene una composición diferente a quitina, lo que correlaciona con resultados previos donde observamos que las esporas no se tiñen con blanco de calcoflúor, colorante fluorescente con gran afinidad por quitina y celulosa. Al analizar las esporas rotas pudimos diferenciar al menos dos estructuras, una central interna de forma redondeada, cubierta por una capa externa con las estructuras cónicas mencionadas previamente; ambas estructuras están separadas por un espacio vacío. En la cubierta externa se pudo distinguir tres capas, una capa exterior de 1.5 μm de espesor en los picos y 0.6 μm en los valles, aproximadamente; una capa interior, en la cual se observa una disposición más uniforme de las fibras con un espesor aproximado de 0.5 μm y una capa intermedia que conecta ambas capas de aproximadamente 0.3 μm. La estructura central redondeada presentó la misma disposición fibrilar que la quitina, con una pared de 0.15 μm de espesor aproximado. Esta estructura sí se tiñó con calcoflúor, corroborando así la presencia de quitina como parte integral de esta capa.Por otra parte, además de conocer la morfología de las esporas, es importante saber cómo está compuesta. Para ello, comenzamos analizando la presencia de polisacáridos, mediante la técnica de Fehling. Utilizamos solo la fracción enriquecida con la estructura exterior o cáscaras, las mismas fueron hidrolizadas con HCl, neutralizadas y luego procesadas para la determinación de azúcares reductores. La reacción fue positiva para la detección de sacáridos en esta estructura externa de las teliosporas, con lo cual podemos afirmar que existen polisacáridos presentes en su composición.Este es el primer reporte respecto a la morfología interna de las teliosporas de T. frezii, lo que, junto a los estudios de composición, los cuales se están comenzando a realizar, permitirán indagar sobre los mecanismos de resistencia de estas estructuras, así como también sobre las distintas estrategias para su control.